LC-MS/MS法测定野生青风藤中木兰花碱和青藤碱含量

杨 林，殷永红

(1.鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院 附属医院)，湖北 黄石 435000；2. 肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 黄石 435000)

青风藤为防己科植物青藤Sinomeniumacutum(Thunb.) Rehd. et Wils. 和毛青藤Sinomeniumacutum(Thunb.) Rehd. et Wils. var.cinereumRehd. et Wils. 的干燥藤茎。每年秋末和冬初进行采割，将其扎成把或切成长段后，晒干保存。青风藤中含有大量的生物碱类化学成分，其中以木兰花碱和青藤碱的含量较高，且研究较为广泛，二者为该植物中主要的生物碱成分。青风藤在中国药典的2015年版一部中有收载，药典标准规定以青风藤植物的干燥品来计算，其中生物碱青藤碱的含量要求不能少于干燥品的0.50%。木兰花碱(magnoflorine，图1 A)，又名木兰碱，别名唐松草碱[1]，被证实具有多种生物学活性，主要包括抗高血压、缓解焦虑、防治肿瘤、对抗炎症、抑制生育以及缓解运动产生的疲劳等药理作用[2～4]；青藤碱(sinomenine，图1 B)具有抗炎免疫、对抗风湿、防治肿瘤和镇痛等生物活性[5, 6]。二者作为青风藤的主要成分，其含量测定对于青风藤的质量控制具有非常重要的现实意义。

图1 木兰花碱(A)和青藤碱(B)的结构式

目前能检索到多篇研究文献，报道了采用高效液相色谱法(HPLC-UV)测定中药青风藤及含有青风藤中药复方中木兰花碱和青藤碱的含量[7, 8, 9]。笔者拟采用高效液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)建立并验证野生青风藤中木兰花碱和青藤碱含量的测定方法，报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器

美国Finnigan公司TSQ Quantum Discovery MAX型液质联用系统(LC-MS /MS，美国Finnigan公司)；赛多利斯Sartorius BS110S电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；AS3120A(铝)型超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；Thermo Micro17R微量台式冷冻离心机(美国Thermo公司)；WH-2 微型漩涡混合器(上海沪西分析仪器厂)。

1.2 试药

野生青风藤采自湖北省宜昌市兴山县。木兰花碱对照品(含量98.0%)购自大连美仑生物技术有限公司，青藤碱对照品(含量94.6%)购自中国食品药品检定研究院。色谱纯甲醇、乙腈购自美国TEDIA(天地)试剂公司；水为娃哈哈饮用纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 色谱及质谱条件 色谱条件：色谱柱为Kromasil Eternity-5 C18 色谱柱(2.1 mm × 50 mm，5 μm)；流动相采用水(A)-乙腈(B)进行梯度洗脱(表1)，流速设置为0.6 mL·min-1；柱温设置为30℃，进样体积为10 μL。

表1 梯度洗脱

质谱条件：电离源采用电喷雾离子化(ESI)电离源；扫描方式采用选择反应监测(SRM)，在正离子模式下进行监测。喷雾电压3500 V；加热毛细管温度(TEM)为270℃；鞘气流速30 psi；辅助气流速15 psi；碰撞气(CID)压力为1.5 mTorr；源内碰撞解离电压(Source CID)为10 V；被测物木兰花碱和青藤碱的检测离子对分别选择m/z 342.4→297.3和330.2→152.2(图2)，碰撞电压分别设置为24 eV和32 eV。

图2 木兰花碱(A)和青藤碱(B)的质谱

1.3.2 对照品溶液的制备 取适量的木兰花碱对照品和青藤碱对照品，分别称取适量各对照品，精密称定，并分别置于100 mL容量瓶中，加入适量色谱甲醇溶液使两种对照品分别溶解完全，然后定容至刻度，配制成木兰花碱和青藤碱浓度分别为412 μg·mL-1和590 μg·mL-1的两对照品储备溶液，并放置于4℃冰箱内进行保存。正式实验前，将两对照品储备溶液进行等体积混合。

1.3.3 供试品溶液的制备 将青风藤药材粉末过三号筛，取出约0.1 g该药材粉末，精密称定，放置于具塞的锥形瓶中，精密量取并加入20 mL70%的乙醇溶液，密塞，并精密称定其重量，超声功率设置为250 W、频率设置为20 kHz，进行20 min的超声处理后，将锥形瓶在室温中放冷，再次称定其重量，用70%乙醇溶液补足超声处理过程中减失的重量，振摇使之混合均匀，取出1 mL提取液的续滤液，放置于100 mL容量瓶中，加入纯甲醇溶液，振摇均匀，并定容至刻度。再次摇匀后，取出稀释后提取液适量，以14 000 r·min-1的转速离心10 min后，吸取上清液置于进样小瓶中，每份样品定量吸取2 μL样品溶液注入LC-MS/MS系统，进行浓度分析。

2 结果与分析

2.1 专属性

分别取空白溶液(甲醇)、木兰花碱和青藤碱混合对照品溶液和供试品溶液采用“1.3.1 色谱及质谱条件”项下的色谱及质谱条件，进样2 μL分析，获得木兰花碱和青藤碱特征色谱图，结果发现方法的专属性良好，被测物木兰花碱和青藤碱不受杂质物质干扰，保留时间、分离度及峰形满足实验要求，见图3。

2.2 标准曲线的建立

分别精密量取木兰花碱和青藤碱混合对照品溶液0.01 mL，0.03 mL，0.05 mL，0.10 mL，0.15 mL和0.20 mL置100 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配制成木兰花碱质量浓度为20.6 ng·mL-1，61.8 ng·mL-1，103 ng·mL-1，206 ng·mL-1，309 ng·mL-1和412 ng·mL-1和青藤碱质量浓度为29.5 ng·mL-1，88.5 ng·mL-1，147.5 ng·mL-1，295 ng·mL-1，442.5 ng·mL-1和590 ng·mL-1的标准系列溶液。按“1.3.1 色谱及质谱条件”项下的色谱及质谱条件进样2 μl进行分析，以被测化合物木兰花碱和青藤碱的选择离子色谱图峰面积为纵坐标，相应的各个化合物质量浓度为横坐标进行线性回归，得到木兰花碱的线性回归方程为Y = 4.509 X + 0.139，相关系数为r2= 0.9996；青藤碱的线性回归方程为Y = 3.915 X + 0.107，相关系数为r2= 0.9998。结果表明，木兰花碱和青藤碱分别在20.6～412 ng·mL-1和29.5～590 ng·mL-1的质量浓度范围内线性关系良好[10]。

2.3 精密度

取被测物混合对照品(木兰花碱浓度为206 ng·mL-1，青藤碱浓度为295 ng·mL-1)溶液按“1.3.1 色谱及质谱条件”项下的色谱及质谱条件进样2 μl，重复测定6次，计算得木兰花碱和青藤碱峰面积的相对标准偏差(RSD，n = 6)分别为1.95%和1.84%，该结果表明方法精密度良好。

A：木兰花碱；B：青藤碱；I：甲醇；II：对照品溶液；III：供试品溶液

2.4 重复性

取同一青风藤药材供试品6份，每份约0.1 g，精密称定，按“1.3.3 供试品溶液的制备”项下供试品溶液的配制方法进行处理，按“1.3.1 色谱及质谱条件”项下的色谱及质谱条件进行测定，测得青风藤中木兰花碱和青藤碱的含量平均值分别为1.96 mg·g-1和5.50 mg·g-1，RSD分别为1.93%和2.00%(n = 6)，该结果表明方法重复性良好。

2.5 稳定性

取同一份青风藤药材供试品溶液，分别于0 h，4 h，8 h，12 h，16 h，20 h和24 h按“1.3.1 色谱及质谱条件”项下的色谱及质谱条件进行测定。木兰花碱和青藤碱峰面积的RSD分别为1.82%和1.65%(n = 7)，该结果表明青风藤供试品溶液中木兰花碱和青藤碱在24 h内保持稳定。

2.6 加样回收率试验

取已知含量的青风藤药材供试品6份，每份约0.05 g，精密称定，按“1.3.3 供试品溶液的制备”项下供试品溶液的配制方法进行处理，并添加适当浓度的混合对照品溶液后，使木兰花碱和青藤碱的理论含量接近测定供试品中木兰花碱和青藤碱含量的80%，100%和120%，每种理论含量各平行配制3份，过滤后，按“1.3.1 色谱及质谱条件”项下的色谱及质谱条件进样测定，回收率结果见表2，结果表明该方法回收率良好。

表2 加样回收率试验结果(n = 3)

2.7 样品含量测定

取青风藤供试品适量，研细成粉末，过三号筛，取药材粉末约0.1 g，精密称定，按“1.3.3 供试品溶液的制备”项下供试品溶液的配制方法处理，按“1.3.1 色谱及质谱条件”项下的色谱及质谱条件进行测定，测得野生青风藤供试品中木兰花碱和青藤碱的含量，结果见表3。

表3 含量测定结果 (mg·g-1)

3 讨论

青风藤作为传统中药，具有较高的临床药用价值，长期以来广泛应用于临床，其味苦性平，归肝、脾经，该味药具有祛风湿、通经络、利小便等功效。青风藤主要含有挥发油、生物碱、脂、甾醇等多类化学成分，其中生物碱类成分为祛风止痛的主要有效成分，具有镇痛、抗炎和免疫抑制与免疫调节等作用[11]。因此青风藤中主要生物碱的含量测定，对于药材的质量控制具有重要意义。

采用LC-MS/MS法建立了野生青风藤中木兰花碱和青藤碱含量的同时测定方法，LC-MS/MS法较前人报道的HPLC-UV法极大的缩短了分析时间，灵敏度显著提高，并提高了分析方法的特异性和专属性。该方法灵敏、快速、准确、稳定，可以应用到野生植物中木兰花碱和青藤碱的含量测定研究中，并为药用植物的质量控制提供一定的理论依据。