氨基酸对铜绿微囊藻生长及叶绿素荧光参数的影响

姚冬梅，张树林，张达娟，张迎

(天津农学院 水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384)

目前，蓝藻水华问题日趋突出，其暴发时不仅对水质产生严重影响，且有些蓝藻种类可产生一系列毒性较强的次级代谢产物，对水生动物及人类健康造成潜在或直接的危害。中国水华蓝藻共有26种，其中微囊藻属Microcystis和鱼腥藻属Anabaena十分常见[1]，随着富营养化水平的加剧，淡水养殖水体水华优势种逐渐演变为微囊藻属一类，且发生面积及频率呈逐年上升趋势。万蕾等[2]研究表明，铜绿微囊藻是引起淡水水华的主要优势种。温度、光照等物理因素通常被认为是水华季节演替的原因，但水华的频繁暴发主要还是归因于水体中氮负荷的加剧所造成的水体富营养化[3]。

目前，关于有机氮对藻类生长影响的相关研究较少，且多是对尿素氮相关研究的报道。如黄文敏等[8]研究表明，铜绿微囊藻能有效吸收利用尿素作为氮源，且高浓度的尿素氮促进其生长。但也有研究发现，有些藻类不能利用尿素氮生长，如Yamaguchi等[9]研究发现，卵圆卡盾藻Chattonellaovata不能利用尿素形态的有机氮，推测其原因可能与该藻细胞内缺少尿素酶有关。而氨基酸作为有机氮的主要存在形式，在水体氮循环中扮演着重要角色[10]，但其在淡水生态系统中的浓度分布有较大差异，如日本琵琶湖氨基酸浓度为4.0～7.2 μmol/L[11]，美国佐治亚洲Satilla河水为59.0 μmol/L[12]，而在以铜绿微囊藻为优势种的太湖中，氨基酸浓度在春季为40.9～60.4 μmol/L，秋季为75.38～93.96 μmol/L[13]。近年来，关于氨基酸方面的研究多为其在自然水体中的释放机制，而通过人为控制其种类和浓度对铜绿微囊藻的研究鲜有报道，如吴轩浩等[4]研究了不同浓度下丙氨酸对铜绿微囊藻生长和产毒的影响，Dai等[14]研究了单一高浓度下6种氨基酸对铜绿微囊藻生长和产毒的影响。这些前期相关研究中，一方面缺乏对自然水体中氨基酸浓度范围的合理选择，另一方面缺乏其对铜绿微囊藻生长产生影响时，叶绿素a含量和相关叶绿素荧光参数的变化情况。

本研究中，通过铜绿微囊藻的分子结构和氨基酸侧链基团极性进行划分[15-16]，选择了天门冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)和甘氨酸(Gly)等6种不同种类的氨基酸，以自然水体中氨基酸浓度范围为界，研究其作为培养基中的唯一添加氮源时，与无氮培养基(不添加氮源)为空白对照时对铜绿微囊藻生长及叶绿素荧光参数的影响，以期为控制自然水体中蓝藻水华暴发的机制提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用藻种铜绿微囊藻(FACHB-905)购自中国科学院水生生物研究所。在BG11 培养基中进行培养，培养温度为(30±1)℃，光照强度为2 000 lx ，光暗周期为12L∶12D。

试验所用藻种在接种之前需进行预处理，在其生长至对数期时，取适量藻种离心浓缩，用无菌蒸馏水洗涤2～3次后接种于无氮培养基BG11中先饥饿培养3 d，使得藻细胞内氮气被消耗殆尽。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

将经过饥饿培养后的铜绿微囊藻分别接种到以天门冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)、 丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)作为唯一添加氮源的培养基中，以无氮培养基作为空白对照，研究6种氨基酸分别在12、25、50、75、100 μmol/L 5个浓度(各氨基酸浓度以氮元素的质量浓度为准)下对铜绿微囊藻生长及叶绿素荧光参数的影响。

各组培养基初始体积均为200 mL，初始接种藻密度约为2×106cells/mL，试验期间，每天摇动藻液，以防止藻细胞贴壁下沉。试验周期为16 d，每组设3个平行，每隔2 d测定藻细胞数量、叶绿素荧光参数等相关指标，并对以上指标进行处理分析，以探明不同种类、不同浓度的氨基酸对铜绿微囊藻生长及叶绿素荧光参数的影响。

1.2.2 指标测定与计算

1) 藻密度。取少量混合均匀的藻液，在显微镜下用血球计数板对藻细胞数量计数两次。若两次相差超过 20%，则需进行第 3 次计数。

2) 叶绿素荧光参数。利用浮游植物荧光仪(PHYTO-PAM) 测定铜绿微囊藻藻液中叶绿素a (Chl-a)含量、叶绿素荧光基础参数及光反应中心PSⅡ光合电子的传递速率(electron transfer rate，ETR)，具体测定参见刘忠荣、游波等[10-12]的方法。根据检测所得叶绿素荧光基础参数(F0、Fm)计算可得到光反应中心 PSⅡ的最大量子产量(即最大光能转化效率,Fv/Fm),其计算公式为

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm。

其中：F0为初始荧光值(minimal fluorescence)；Fm为最大荧光值(maximal fluorescence)。

1.3 数据处理

试验结果以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，采用 SPSS 20.0软件对试验数据进行方差分析，采用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 铜绿微囊藻的生长变化

控制对照组和各试验组的初始接种藻细胞数量为2×106cells/mL。从图1可见：在试验期间，对照组的藻细胞数量在第2～6 天时略有上升，但始终低于各氨基酸试验组，约为各氨基酸试验组最低浓度时平均藻细胞数量的2/3；各氨基酸试验组藻细胞数量在不同浓度下存在显著性差异(P<0.05)。

随着氨基酸浓度的升高，各氨基酸试验组平均藻细胞数量发生明显的变化，其中，谷氨酸试验组平均藻细胞数量呈先上升后下降的趋势，在氨基酸浓度为75 μmol/L时达到峰值3.78×106cells/mL；除谷氨酸试验组外，其他5种氨基酸试验组平均藻细胞数量均呈上升趋势，在氨基酸浓度为100 μmol/L时均达到最高值(图1)。

随着培养时间的延长，除谷氨酸试验组藻细胞数量波动较明显以外，其他5种氨基酸试验组藻细胞生长整体均呈先上升后下降趋势，除丙氨酸试验组藻细胞数量于第4天时出现最大值外，其他5种氨基酸试验组藻细胞数量最大值均出现在第8天(图1)。

图1 氨基酸对铜绿微囊藻生长的影响

2.2 氨基酸对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响

从表1可见：各氨基酸试验组不同浓度下Chl-a含量均存在明显差异，随着氨基酸浓度的升高，各氨基酸试验组平均Chl-a含量总体上呈上升趋势；天门冬氨酸浓度为100 μmol/L时，分别在第2、4、10、12、14、16天时达到最高值，丝氨酸浓度为100 μmol/L时各培养时间下均达到最高值，精氨酸浓度为100 μmol/L时，除第2天外，其余各时间点均达到最大值，谷氨酸浓度为100 μmol/L时，分别在第8、10、12、14天时达到最大值。

随着试验的进行，对照组的Chl-a含量总体呈下降趋势；除谷氨酸试验组波动较明显以外，其他5种氨基酸试验组在不同浓度下的Chl-a含量随着培养时间的延长，总体上均呈先上升后下降的趋势，Chl-a含量最大值均出现在培养的第8天；各氨基酸试验组Chl-a含量变化情况总体上为天门冬氨酸试验组中的Chl-a含量最高，其次为丝氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸，其中，甘氨酸试验组的Chl-a含量最低，且高浓度(50、75、100 μmol/L)试验组中的Chl-a含量明显高于低浓度(12、25 μmol/L)试验组(表1)。

表1 氨基酸对铜绿微囊藻Chl-a含量的影响

2.3 氨基酸对铜绿微囊藻Fv/Fm 的影响

从表2可见：各氨基酸试验组不同浓度下Fv/Fm值均存在明显差异，随着氨基酸浓度的升高，各氨基酸试验组Fv/Fm值总体上均呈上升趋势；天门冬氨酸浓度为100 μmol/L时，在第8天达时到最高值，丝氨酸浓度为100 μmol/L时，分别在第10、12、14、16天时达到最高值，丙氨酸浓度为100 μmol/L时，分别在第6、8、10、12、16天时达到最高值。

表2 氨基酸对铜绿微囊藻Fv/Fm的影响

随着培养时间的延长，对照组的Fv/Fm值总体上呈下降趋势；除谷氨酸试验组波动较明显以外，其他5种氨基酸试验组在不同浓度下的Fv/Fm值总体上均呈先上升后下降的趋势，Fv/Fm值最大值均出现在培养的第8天，各氨基酸试验组Fv/Fm值变化情况总体上为天门冬氨酸试验组中的Fv/Fm值最高，其次为丝氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸，其中，甘氨酸试验组的Fv/Fm值最低。

2.4 氨基酸对铜绿微囊藻ETR的影响

从表3可见：各氨基酸试验组不同浓度下ETR值均存在明显差异，随着氨基酸浓度的升高，各氨基酸试验组平均ETR值总体上呈上升趋势；天门冬氨酸浓度为100 μmol/L时，分别在第2、8天时达到最高值，丝氨酸浓度为100 μmol/L时，除第16天外其余各时间点均达到最高值，丙氨酸浓度为100 μmol/L时，分别在2、4、6天时达到最高值，甘氨酸浓度为100 μmol/L时，分别在第4、10、12、14、16天时达到最高值。

表3 氨基酸对铜绿微囊藻ETR的影响

随着试验的进行，对照组的ETR值总体上呈下降趋势；除谷氨酸试验组波动较明显以外，其他5种氨基酸试验组在不同浓度下的ETR随着培养时间的延长总体上均呈先上升后下降的趋势，ETR最大值均出现在培养的第6～8 天，各氨基酸试验组ETR变化情况总体上为天门冬氨酸试验组中的ETR最高，其次为丝氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸，其中，甘氨酸试验组的ETR最低。

3 讨论

3.1 氨基酸对铜绿微囊藻生长及叶绿素a含量的影响

氮浓度和氮的存在形态均会对铜绿微囊藻生长繁殖起到至关重要的作用，氨基酸作为小分子，能够通过主动转运的方式被藻细胞吸收进入细胞内，提高微囊藻对其的吸收效率，进而影响微囊藻的生长繁殖[4]。本研究结果发现，除谷氨酸试验组外，其他5种氨基酸试验组平均藻细胞数量随着氨基酸浓度的升高均呈上升趋势，且多种氨基酸在浓度为100 μmol/L时达到最高值，表明这5种氨基酸均能支持铜绿微囊藻的持续生长，而铜绿微囊藻细胞对氨基酸的利用程度依次为为天门冬氨酸> 丝氨酸>精氨酸>谷氨酸>丙氨酸>甘氨酸，这表明天门冬氨酸、丝氨酸对铜绿微囊藻的促生长效应最高。Dai 等[14]研究表明，铜绿微囊藻在丙氨酸、亮氨酸和精氨酸作为单一氮源时生长良好，而在谷氨酸和天冬氨酸存在下铜绿微囊藻生长最快却不能支持其持续生长，此结果与本研究结果有明显差异，这是因为Dai等仅监测了铜绿微囊藻240 h的生长情况，而忽略了铜绿微囊藻的生长周期，同时，光照强度为400～650 lx和培养温度为26 ℃均不是铜绿微囊藻适宜的生长条件，存在一定局限性，而本研究中以铜绿微囊藻的生长曲线和最适生长条件为基础，能突出氨基酸对铜绿微囊藻生长的周期变化。而本研究中谷氨酸培养基中藻细胞数量在试验前期持续降低，并于第8天时藻密度突然开始增高的现象仍需进一步研究。

铜绿微囊藻细胞内的Chl-a主要位于光合系统Ⅱ(SPⅡ)的核心复合体上，能吸收能量传递到反应中心进行光化学反应[17]，当藻细胞受到环境胁迫时，会直接或间接地影响到Chl-a含量，因而Chl-a含量变化可以作为藻类受到胁迫的生理反应指标[18]。本研究中，对照组Chl-a含量总体上呈下降趋势，一方面与藻细胞数量的变化有关，另一方面是藻类处于无氮状态受到环境胁迫所致。甘小蓉等[19]在研究化学物质对铜绿微囊藻生长和叶绿素荧光参数时发现，Chl-a含量的变化符合藻细胞数量的变化特征，而本研究结果同样发现，Chl-a含量变化和藻细胞数量变化特征相符合，这表明添加不同浓度、不同种类的氨基酸对藻细胞数量造成影响时，Chl-a含量也会随之变化。华汝成[20]和张亚丽等[21]关于无机氮的研究结果发现，低浓度氮对Chl-a有抑制作用，高浓度氮对Chl-a有促进作用，在一定浓度范围内Chl-a含量随着氮浓度的增大而升高，与本研究中低浓度氮对Chl-a仍有促进作用的结果不同，由于叶绿素a含量还会受光合营养条件的影响[22]，因此，这可能是无机氮和有机氮参与叶绿素合成机制的不同所导致的。相关研究中，应当模拟自然水体蓝藻暴发期夏季涉及的所有温度、光照强度等条件，通过响应面分析氨基酸在多种条件下对铜绿微囊藻Chl-a的作用机制，从而进一步了解蓝藻暴发期的藻细胞生长和Chl-a的变化特征。

3.2 氨基酸对铜绿微囊藻叶绿素荧光参数的影响

叶绿素荧光参数Fv/Fm通常用来判断植物是否受到条件抑制，它反映了光反应中心 PSⅡ的最大量子产量(即最大光能转化效率)，该值下降则表明植物受到了环境胁迫[21]。本研究中，对照组的Fv/Fm值整体呈下降趋势，与对照组处于无氮状态受到环境胁迫的表现相对应，表明无氮胁迫下铜绿微囊藻PSⅡ最大光能转化效率下降，PSⅡ天线色素吸收的光能用于光化学电子传递的份额降低，会进一步导致ETR值的下降，这是缺乏氮源时叶绿素荧光参数Fv/Fm值的正常变化[23]。本研究中，随着氨基酸浓度的升高，各氨基酸试验组平均Fv/Fm值均呈上升趋势，这是由于氮元素是蛋白质、叶绿素与光合作用有关的酶的必要组成成分，随着氮浓度的升高，PSⅡ需求的光能大于吸收的光能，其活性反应中心活跃，光能转化效率提高，从而导致Fv/Fm值升高[24-25]。Fv/Fm值的总体变化趋势与Chl-a含量的变化相似，Chl-a和Fv/Fm均反映了光合速率变化的特征，以及叶绿素荧光参数对转能效率的影响[26]。

ETR表示光反应中心 PSⅡ光合电子的传递速率[27]，其传递效率的状态可反映光合作用的动态变化及各种外界因素对藻类的微妙影响[28-29]，如王昭玉[30]利用叶绿素荧光参数ETR对氮指标的响应判断山东青岛近海氮的反应情况。本研究中，对照组的ETR值总体呈下降趋势，与各叶绿素荧光参数表现的结果一致，是光合作用各反应受到抑制的表现，与其受到环境胁迫的影响密不可分[27]。

本研究中，随着氨基酸浓度的升高，各氨基酸试验组平均ETR值大致呈上升趋势。ETR值的显著升高与氮浓度的升高密不可分，是活性反应中心活跃、电子传递效率提高的正常现象[24-25]。ETR值的整体变化趋势与相关叶绿素荧光参数的表现相似，是光合作用中光能吸收、光化学反应、电子传递共同表现的结果，反映了叶绿素荧光参数的重要作用[27]，与其他氨基酸相比，不同浓度的谷氨酸对铜绿微囊藻生长及叶绿素荧光参数的影响有较大差异，表明铜绿微囊藻生长过程中对不同浓度谷氨酸氮吸收是不稳定的。

4 结论

1) 在所设置氨基酸浓度(12、25、50、75、100 μmol/L) 范围内，各氨基酸试验组在不同浓度下藻细胞数量、Chl-a含量、Fv/Fm及ETR值均存在明显差异，其反映的结果基本符合铜绿微囊藻生长过程中的延滞期、对数生长期和稳定期的规律。

2) 从4种测定指标的结果发现，无氮对照组数值显著低于各氨基酸试验组，一定程度上反映了环境胁迫下藻细胞数量及相关叶绿素荧光参数的下降是铜绿微囊藻在逆境条件下的正常反应。

3) 随着氨基酸浓度的升高，天门冬氨酸、丝氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸及甘氨酸均能逐渐促进铜绿微囊藻的生长及相关叶绿素荧光参数的提高，且叶绿素荧光参数与藻细胞数量呈正相关关系。

4) 随着培养时间的延长，铜绿微囊藻在天门冬氨酸、丝氨酸试验组中生长状况最好，在甘氨酸试验组生长状况较差，相关叶绿素荧光参数也随之产生相应的变化，这充分反映出氮对铜绿微囊藻的分裂增殖及其正常代谢过程的控制作用，以及Fv/Fm等叶绿素荧光参数作为铜绿微囊藻氮监测的响应指示作用。

5) 本研究中设定的氨基酸浓度，覆盖了自然水体中已知的氨基酸含量范围，较好地模拟了自然水体中铜绿微囊藻的生长、叶绿素a含量及叶绿素荧光参数的动态变化，研究结果可为控制自然水体中蓝藻水华暴发的机制提供一定的基础数据参考。