马铃薯病毒病病原研究

杨茹薇 邢斌德 刘易 徐琳黎 孙慧

摘 要：从新疆乌鲁木齐县、吉木萨尔县主产县采集共92份马铃薯样本，使用植物检测病毒抗血清进行ELISA检测，摸清当前乌鲁木齐周边地区马铃薯病毒的种类和染毒率，全面掌握马铃薯病毒的发生情况，以期为有效防治病毒病提供重要科学依据。

关键词：马铃薯;病毒病;ELISA检测

中图分类号 S435.32文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）09-0096-03

Abstract： This test from the xinjiang urumqi county， jimsar which collected a total of 92 potato samples， the plants were used to detect virus antiserum for ELISA test， find out the current urumqi surrounding areas and the kinds of potato virus infected rate， a comprehensive grasp of potato viruses， provide important basis for effective prevention and treatment of viral diseases.

Key words： The potato; Virus disease; ELISA detection

马铃薯是茄科茄属一年生草本植物，是一种兼具营养价值和药用价值的食用块茎作物[1]。马铃薯是世界第四大粮食作物中增長潜力最大的作物，其产业链长，是重要的经济作物和工业原料作物。马铃薯在保障国家粮食安全、推进农业结构调整和促进农民持续增收等方面有着不可替代的重要作用。而马铃薯病毒病是马铃薯的主要病害，一般使马铃薯减产20%～50%，严重的达80%以上[2]。感染病毒的马铃薯通过无性繁殖进行世代积累和传递，致使产量不断下降，不能留种再生产，严重制约了马铃薯产业的发展。

蚜虫传播、接触传播和摩擦传播是马铃薯病毒病的主要传播途径[3、4]。马铃薯可以受到1种病毒的单独侵染或几种病毒的复合侵染。常见感染马铃薯病毒的种类有10余种，造成严重危害的主要是PVX、PVY、PVS、PVA、PVM、PLRV。对病毒病的防治目前尚无特效药，现阶段主要以预防为主，脱毒生产技术防治为主，高效可靠的病毒检测是重要种薯质量控制方法[5]。目前酶联免疫吸附法和分子鉴定广泛用于检测操作中，本试验应用酶联免疫吸附技术对乌鲁木齐县和吉木萨尔县马铃薯病毒病进行了调查和鉴定，以为更有效地防治马铃薯病毒病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 样本材料包括乌鲁木齐县、吉木萨县试管苗44份，原原种16份，原种20份，商品薯12份，共92份样本。

采用马铃薯病毒检测试剂盒，包括马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）。材料包括96孔包被抗体的微孔板、碱性磷酸酶标记物、ECI缓冲液、PNP底物缓冲液、阳性质控物、PBST洗涤缓冲液、吐温、通用样品提取缓冲液、研钵、密封盒、吸水纸、蒸馏水、酶联仪、微量移液器、恒温箱、离心机、冰箱等。

2 试验方法

2.1 配置缓冲溶液 用蒸馏水将配置20倍的PBST缓冲液400mL，使用蒸馏水配置5倍的ECI缓冲液和PNP缓冲液50mL。

2.2 质控物溶液的制备 用样品提取缓冲液2mL溶解阳性质控物干粉，轻轻摇匀后在4℃条件下贮存，在使用前完全回温后使用。

2.3 样品的提取及稀释 采集马铃薯叶片作为ELISA实验的检测样本，每份样品提取后需彻底清洗研钵，以免造成样品间的相互污染。取0.1g马铃薯叶片加入1mL提取缓冲液研磨提取离心。样本研磨后，将提取液与提取缓冲液以1∶10的比例混合均匀。

2.4 点样及孵育 根据样本设计图，100uL样品提取稀释液到各样品孔中，取100uL阳性质控物溶液到阳性对照孔中，并在25℃恒湿箱中孵育2小时反应。

2.5 酶标记物的制备 先将ECI缓冲液稀释到1倍，后将酶标记物加到ECI缓冲液中制备50mL，混合均匀，酶标记物在孵板结束前的10min内制备完成。

2.6 洗板及加酶标记物稀释液 孵育结束后，将反应孔中的试剂倒出，加入250uL的1倍PBST缓冲液，之后快速倒出，重复6～8次，将微孔板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留液体。在各反应孔中加入100uL酶标记物稀释液。

2.7 孵育及PNP底物的制备 在25℃恒湿箱中孵育2h，孵育结束前的15min制备PNP底物溶液。在室温下用5mL PNP缓冲液（1倍浓度）溶解1片PNP底物片。避免直接接触PNP底物片或将底物溶液暴露在强光下，直接接触或强光刺激会在阴性反应孔中导致背景色干扰。

2.8 洗板、加PNP底物溶液、孵育 洗板同2.6，在各反应孔中加入100uL PNP底物溶液。在恒湿箱中黑暗孵育60min，避免光直射或强光。

2.9 数据判定 使用酶标仪在405nm波长下测量结果，数值高于阴性对照2倍数值，判定为阳性，小于或等于阴性对照的判断为阴性。

3 结果和分析

3.1 不同马铃薯样本的病毒检出率 通过对乌鲁木齐周边主产县的92份样本的检测结果，对样本进行PVX、PVY、PVS、PLRV病毒检测，其中PLRV检测率为0，PVS检测率最高，试管苗为4.55%，原原种为12.5%，商品薯为8.33%，原种为5%。其次PVY病毒带毒率偏高，原种检测率为15%，商品薯为8.33%。PVX有零星发生，未脱毒试管苗带毒率2.27%。其中PVS在4种病毒中样本检测率最高，达6.52%，说明大田生产中该病毒侵染力强，实验室脱毒较难脱去，造成PVS检测率高于原原种及试管苗。其次为PVY在3种样本中均发生，说明该病毒较其他病毒难脱除，且脱毒率低于PVS。

3.2 不同马铃薯品种的病毒检出率 从表2得出，检测92份样本材料中16个品种都不含PLRV病毒，其中T系列1个样本检测带PVX，冀张薯12号、黑金刚、大西洋、T系列5个样本检测带PVY，T系列、红宝石品种6个样本检测带PVS，其中T5品种携带2种病毒，所有品种带毒检测率为13.04%。

4 结论

通过对乌鲁木齐地区周边马铃薯样本的检测可知，马铃薯种苗不是完全符合脱毒种薯的标准要求，需连续对农民使用的种薯进行病毒检测，为使用脱毒种薯提供保证。由于病毒检测试剂盒只能定量分析，微量病毒的检测还需分子方法鉴定分析。目前原种和商品薯检测率分别为80%、83.33%，说明脱毒种薯的质量还需进一步提高。在种薯生产各环节中，定期病毒检测的质量监测至关重要，只有从源头保证无毒侵染，才能保证种薯繁育质量。

马铃薯病毒与蚜虫传播及大田生产中切种和机械等操作有关，在各环节应注意工具消毒，及时预防并控制蚜虫种群数量，适时杀秧，从基本环节降低病毒的发生和侵染传播。

参考文献

[1]SALAZARL.F.马铃薯病毒及其防治[M].阎文昭，张勇飞，译.北京：中国农业科学技术出版社，2000.

[2]吴丽萍，王蒂，司怀军，等.马铃薯S病毒的RT-PCR检测[J].中国马铃薯，2006，20（4）：200-203.

[3]肖雅，何长征，聂先舟等.马铃薯病毒病防治策略[J].中国马铃薯，2008（2）：106-110.

[4]王子民，时家宁，宫海建.马铃薯病毒病的发生及防治[J].现代农业科学，2009（7）：118.

[5]吴兴泉，陈士华，谢联辉.马铃薯X病毒的分子鉴定与检测技术[J].河南农业科学，2005（2）：72-75.

（责编：王慧晴）