六味地黄丸药渣中4种活性成分含量测定及 抗氧化活性研究

梁诗瑶 刘倩倩 黄胜 颜冬兰 林丽美 吴萍

〔摘要〕 目的 采用HPLC法测定六味地黄丸药渣中丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸、熊果酸的含量，并评价六味地黄丸药渣及单味饮片（熟地黄、泽泻、牡丹皮、山茱萸）药渣的体外抗氧化活性。方法 Waters Athena C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.08%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱;柱温为35 ℃;流速1.0 mL/min;检测波长为210 nm;进样量10 μL。采用ABTS法、DPPH法以及FRAP法测定六味地黄丸药渣的抗氧化能力。结果 丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸、熊果酸分别在0.004～0.040、0.078～0.780、0.048～0.480、0.052～0.520 μg范围内线性关系良好;平均加样回收率分别为103.47%、97.14%、103.92%、100.18%（RSD<3.0%，n=6）。六味地黄丸药渣和单味饮片药渣对DPPH、ABTS自由基清除作用和Fe3+还原能力均较好;其中牡丹皮、山茱萸药渣的总体抗氧化效果优于其他药渣，二者在低浓度2 mg/mL时有一定的清除率，且随着浓度的增加，最高清除率可分别达到84.51%和76.39%。结论 该含量测定方法准确可靠，证实了药渣中还残留大量的活性成分，且具有良好的抗氧化生物活性。表明六味地黄丸药渣具有一定的营养价值，为药渣的综合开发利用提供依据。

〔關键词〕 六味地黄丸药渣;HPLC;丹皮酚;23-乙酰泽泻醇B;茯苓酸;熊果酸;含量测定

〔中图分类号〕R284.1       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.05.010

Determination of Four Active Components in Liuwei Dihuang Pill Residue and Its

Antioxidant Activity

LIANG Shiyao1，2， LIU Qianqian1，2， HUANG Sheng2， YAN Donglan2， LIN Limei1，2*， WU Ping1，2*

（1. Key Laboratory of Hunan Province for Quality Evaluation of Bulk Medicinal MaterialsProduced in Hunan Province， Changsha， Hunan 410000， China; 2. Jiuzhitang Limited Company， Changsha， Hunan 410000， China）

〔Abstract〕 Objective To establish a HPLC method for the simultaneous determination of paeonol， 23-acetyl alisol B， poria acid and ursolic acid in Liuwei Dihuang Pill residue， and to evaluate the in vitro antioxidant activity of Liuwei Dihuang Pill residue and dregs of single decoction pieces [Shudihuang （Rehmanniae Radix Praeparata）， Zexie （Alismatis Rhizoma）， Mudanpi （Moutan Cortex）， Shanzhuyu （Corni Fructus）] Methods Waters Athena C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used. Acetonitrile and 0.08% phosphoric acid were used as mobile phase for gradient elution. The column temperature was 35 ℃， the flow rate was 1.0 mL/min， the detection wavelength was 210 nm， and the injection volume was 10 μL. The antioxidant capacity of Liuwei Dihuang Pill residue was determined by ABTS method， DPPH method and FRAP method. Results The linear relationship of paeonol， 23-acetyl alisol B， poria acid and ursolic acid was good in the range of 0.004～0.040， 0.078～0.780， 0.048～0.480， 0.052～0.520 μg， and the average recovery rate was 103.47%， 97.14%， 103.92% and 100.18% （RSD < 3.0%， n=6）. Liuwei Dihuang Pill residue and dregs of single decoction pieces had good scavenging effect on DPPH， ABTS free radical and Fe3+ reduction ability; the overall antioxidant effect of Mudanpi （Moutan Cortex） and Shanzhuyu （Corni Fructus） residue was better than other drug residues， and they had certain scavenging rate at low concentration （2 mg/mL）， and the highest scavenging rate could reach 84.51% and 76.39% respectively with the increase of concentration. Conclusion The method is accurate and reliable， which proves that there are a lot of active ingredients in the residues. The pharmacological experiments also further verify that the residues of Liuwei Dihuang Pill residue and dregs of single decoction pieces have good antioxidant biological activity. The residue of Liuwei Dihuang Pill have certain nutritional value， which provides the basis for the comprehensive development and utilization of the residue.

〔Keywords〕 Liuwei Dihuang Pill residue; HPLC; paeonol; 23-acetyl alisol B; poria acid; ursolic acid; content determination

随着中药产业的快速发展，中药药渣的排放量在逐年增加，形成了目前既浪费资源又污染环境的困境。六味地黄丸收载于《中华人民共和国药典》（2020年版）一部，主要由熟地黄、山药、泽泻、山茱萸、牡丹皮和茯苓6味药材经过提取浓缩而成，具有滋阴补肾之功效，是一个具有代表性的名优中成药大品种其药渣每年就可达3 000吨[1-3]。现代研究[4-5]表明，六味地黄丸主要含有环烯醚萜类、三萜类及其苷类、甾醇类及挥发性成分等，具有降血糖、降血脂、增强免疫、延缓衰老及防癌抗癌等作用。方中牡丹皮含有酚酸类代表性成分丹皮酚，具有抗炎、改善血液流变性、抗动脉粥样硬化、保护缺血组织等多种生物活性[6-7];泽泻中含有三萜类代表性成分泽泻醇，其中23-乙酰泽泻醇B对动脉粥样硬化、肾炎等疾病有一定疗效[8];山茱萸含有马钱苷、熊果酸等成分，其中熊果酸能選择性诱导活化型HSC凋亡及抗纤维化机制，且对肝癌细胞SMMC-7721增殖有明显抑制作用[9];茯苓中的有效成分茯苓酸具有免疫调节活性，体外能减弱由LPS及ConA刺激小鼠脾细胞的代谢活力[10]。六味地黄丸药渣中是否还有这些活性成分的保留，值得进一步研究。

抗氧化剂能够减少自由基对机体的氧化损伤，能有效抑制疾病的发生。现代药理研究[11]表明六味地黄丸具有抗氧化活性，但是对其药渣及各单味饮片药渣抗氧化活性研究未见报道。基于此，本文以六味地黄丸药渣为例，采用HPLC法同时测定六味地黄丸药渣中丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸、熊果酸4种活性成分的含量;同时，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）[12-13]自由基清除法和铁离子还原法（FRAP）对比分析六味地黄丸药渣及单味饮片药渣醇提取物体外抗氧化活性，现报道如下。

1 仪器与材料

1.1  仪器

Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）;SQP型十万分之一电子天平（赛多利斯公司科学仪器有限公司）;KQ-500DE数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）;Multiskan MK3多功能酶标仪（美国Thermo公司）。

1.2  材料

丹皮酚（批号：wkq20011305）、23-乙酰泽泻醇B（批号：wkq18112311）、熊果酸（批号：wkq19120908）均购自四川省维克奇生物科技有限公司，质量分数均

≥98%;茯苓酸（批号：DST200216-001）购自德思特生物有限公司，纯度≥98%;DPPH（416C021，北京索莱宝科技有限公司）;ABTS试剂盒（产品编号：S0119）、FRAP试剂盒（产品编号：S0116）均购自碧云天生物技术研究所;乙腈、甲酸为色谱纯;水为超纯水;其余试剂均为分析纯。实验用六味地黄丸药渣（九芝堂股份有限公司）晒干粉碎后，过60目筛，备用。

2 方法

2.1  含量测定

2.1.1  供试品溶液的制备  精密称取六味地黄丸药渣粉末（过80目筛）约1 g，置具塞锥形瓶中，加入10 mL乙酸乙酯超声（功率250 W，频率40 kHz） 30 min，取出1 500 r/min离心5 min后收集上清液，再加入乙酸乙酯10 mL超声30 min，离心后合并两次上清液，将乙酸乙酯挥干后用甲醇溶解稀释，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液用HPLC进样分析。

2.1.2  对照品溶液的制备  精密称取标准品丹皮酚2.04 mg、熊果酸3.00 mg、茯苓酸1.38 mg，分别置于10 mL的容量瓶中;精密称取标准品23-乙酰泽泻醇B 2.45 mg置于25 mL的容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得各标准品母液的浓度分别为0.204、0.30、0.138、0.098 mg/mL。分别取丹皮酚溶液、熊果酸溶液、茯苓酸溶液、23-乙酰泽泻醇B溶液0.12、0.87、1.74、4.00 mL置10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，4个标准品混合溶液浓度分别为0.002、0.026、0.024、0.039 mg/mL，作为混合对照品溶液。

2.1.3  色谱条件  色谱柱：Athena C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：乙腈（A）-0.08%磷酸溶液（C），梯度洗脱（0～10 min，5%～65% A;10～40 min，65%～80% A;40～60 min，80%～95% A）;流速：1.0 mL/min;检测波长：238 nm、210 nm;柱温：30 ℃;进样量：10 μL。

2.1.4  线性关系考察  分别精密吸取上述“2.1.2”项下混合对照品溶液2、4、8、10、15、20 μL，注入液相色谱仪，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，以对照品溶液的质量（μg）为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线。结果表明：丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸和熊果酸在测定浓度范围内的线性关系良好。见表1。

2.1.5  方法学考察  （1）精密度试验 取混合对照品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算得到丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸、熊果酸峰面积的RSD分别为1.17%、0.46%、0.63%、0.67%，表明本法仪器精密度较好。

（2）稳定性试验 取同一供试品溶液10 μL，分别放置0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录峰面积积分值，计算得到丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸、熊果酸峰面积的RSD分别为2.79%、1.86%、1.73%、2.82%，表明该方法稳定性良好。

（3）重复性试验 取同一样品粉末约0.5 g，按“2.1.1”项下方法制备平行6份供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算得到丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸、熊果酸峰面积的RSD分别为2.41%、1.77%、2.10%、2.05%，表明该方法重复性良好。

（4）加样回收试验 取已知含量的六味地黄丸药渣6份（丹皮酚0.020 mg/g、23-乙酰泽泻醇B 0.934 mg/g、茯苓酸0.294 mg/g、熊果酸0.382 mg/g计），每份约0.5 g，加入用乙酸乙酯溶液制成的丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸、熊果酸混合对照品溶液（丹皮酚0.0006 mg/mL、23-乙酰泽泻醇B 0.0200 mg/mL、茯苓酸0.0150 mg/mL、熊果酸0.0023 mg/mL），按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率及RSD，测定并计算4种待测成分的平均加样回收率和RSD值。见表2。

2.2  抗氧化活性研究

2.2.1  样品制备  分别精密称取六味地黄丸药渣和熟地黄、泽泻、牡丹皮、山茱萸药渣各100 mg于2 mL的EP试管中，各加1 mL甲醇，超声提取1 h，冷却后用0.22 μm微孔滤膜过滤，得到浓度为100 mg/mL的滤液。

2.2.2  清除DPPH自由基  准确称量DPPH溶液10 mg于250 mL的棕色容量瓶中，甲醇配制，得到浓度为0.04 mg/mL。分别取六味地黄丸药渣醇提液20 μL至200 μL DPPH中，室温静置30 min，515 nm处测定吸光度结果为A1，甲醇为试剂空白为A2，DPPH溶液为对照为A0，Trolox作参比，计算六味地黄丸药渣和单味饮片药渣醇提液对DPPH自由基的清除率（实验操作平行3次）。

DPPH自由基的清除率=×100%

2.2.3  清除ABTS自由基  在检测孔中加入ABTS工作液200 μL，随后在检测孔和对照孔分别加入10 μL各浓度样品和10 μL甲醇，轻轻混匀后室温孵育6 min，在405 nm处吸光度A。以蒸馏水为空白对照，吸光度为A0，以Trolox作参比，计算六味地黄丸药渣和单味饮片药渣醇提液对ABTS+自由基的清除率（实验操作平行3次）。

ABTS自由基的清除率=×100%

2.2.4  FRAP法测定抗氧化能力  取27.8 mg FeSO4·7H2O加水定容至1 mL，制成浓度为100 mmol/L的标准FeSO4溶液，进一步稀释后得0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L，用乙醇为溶剂，分别取5 μL各浓度的药渣醇提液至180 μL TPTZ工作液中，37 ℃反应5 min，在570 nm处测吸光度。以FeSO4标准溶液代替样品，按照上述方法测定绘制标准曲线，依据FRAP标准曲线计算各样品溶液的抗氧化活性。以Trolox作参比（实验操作平行3次）。

2.3  统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件处理数据，所得实验数据均为3次重復实验结果的均值;采用GraphPad Prism 8软件绘图。

3 结果

3.1  共有峰的确定与指认

对六味地黄丸药渣及单味饮片药渣建立如图1所示的指纹图谱，对其中的共有峰用对照品进行指认，明确了1、2、3、4号峰分别归属于丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸、熊果酸。

3.2  活性成分含量测定

精密称取六味地黄丸药渣，按“2.1.1”项下方法制得供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进HPLC分析，通过回归方程计算各个成分的峰面积在药渣中的质量分数。结果表明，六味地黄丸药渣中丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸和熊果酸活性成分的含量分别为（0.020±0.002）、（0.928±0.003）、（0.292±0.003）、（0.377±0.006） mg/g。

3.3  不同浓度六味地黄丸药渣和单味饮片药渣醇提液对DPPH、ABTS自由基清除能力

由图2可知，在实验的剂量范围内，不同浓度六味地黄丸药渣和熟地黄药渣、泽泻药渣、牡丹皮药渣、山茱萸药渣醇提液对DPPH、ABTS自由基的清除作用均随浓度升高而逐渐增强，呈量效关系。六味地黄丸药渣在浓度为10 mg/mL以下时，其清除率均小于50%，无明显抗氧化作用;而在25 mg/mL浓度时，对DPPH自由基有较好的清除作用，其清除率达77.96%，对ABTS自由基的清除率达69.29%，抑制效果低于Trolox，且六味地黄丸药渣有相同浓度下Trolox DPPH和ABTS清除能力的81.40%和72.35%。

3.4  FRAP法测定不同浓度六味地黄丸药渣和单味饮片药渣醇提液抗氧化能力

由图3可知，在实验的剂量范围内，不同浓度六味地黄丸药渣和单味饮片药渣醇提液的FeSO4当量值均随浓度升高而逐渐增加，呈量效关系。六味地黄丸药渣在浓度为15 mg/mL以下时，其醇提液的FeSO4当量值都比较低，无明显抗氧化作用;而在25 mg/mL浓度时，抗氧化能力较好，其FeSO4当量值为1.30 mmol/g，抑制效果低于阳性对照物，总抗氧化能力为相同浓度下Trolox的57.78%。

4 讨论

王晓燕等[14]利用HPLC法同时测定了六味地黄丸中4种活性成分（莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷和丹皮酚）的含量，其主要集中在环烯醚萜类化合物上，对于三萜类成分却研究较少。故本课题对六味地黄丸药渣中丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸和熊果酸4种主要成分同时进行HPLC定量分析，方法简单准确，从测定结果看，六味地黄丸药渣中23-乙酰泽泻醇B和熊果酸含量较高，说明药渣仍有可利用价值。

3种抗氧化实验结果表明，低浓度六味地黄丸药渣及单味饮片药渣醇提物不具有抗氧化作用，但随着其浓度的增加，抗氧化作用不断增强，呈量效关系，IC50值是清除率为50%时的浓度值，其值越小，表明其抗氧化能力越强。由SPSS 21.0计算各样品的IC50值大小依次为泽泻药渣（16.163）、六味地黄丸药渣（10.799）、熟地黄药渣（8.004）、山茱萸药渣（0.657）、牡丹皮药渣（0.387），结果表明，山茱萸、牡丹皮药渣有较强的抗氧化能力，提示其有一定的价值。

因此，对于六味地黄丸药渣而言，无论是从其成分方面还是其活性方面，都有其可以进行开发利用的价值。课题组拟进一步考查六味地黄丸药渣中粗纤维、蛋白等的含量，为其开发利用提供更加明确的方向。

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