马尾松与乡土阔叶树种凋落叶混合分解过程中微生物生物量特征

张艳，李勋，宋思梦，周扬，张健

1.四川民族学院横断山区生态修复与特色产业培育研究中心，四川 康定 626001；2.四川农业大学林学院生态林业研究所/生态林业工程重点实验室/长江上游生态安全协同创新中心，四川 成都 611130

微生物一直都被认为是森林中凋落物的重要分解者和还原者，直接参与森林中土壤与凋落物的各种生物化学进程。微生物活体的总物质量被认为是微生物生物量，微生物生物量可以用作参与营养循环和凋落物分解过程中微生物数量的参考指标之一，同时也可用作评估土壤肥力的一个重要参考指标（胡亚林等，2005）。凋落物的质量和数量可以通过影响微生物对分解底物的控制程度以及对难降解物质的分解程度，继而对微生物生物量产生一定的影响（Wardle，2010）。如Hu et al.（2005）的研究发现，杉木林转变为杉阔混交林后凋落物化学组成的变化可以影响土壤微生物，且会因为阔叶比重的增加在一定程度上改善土壤养分情况和增加微生物的活性。微生物生物量碳（MBC）含量主要是表征凋落物在分解过程中活体微生物的生物量以及数量（Larsen et al.，2002）。微生物生物量氮（MBN）含量一直是反映微生物在凋落物分解过程中利用N特性的重要指标之一，更是凋落物在分解过程当中N的释放以及转化的重要环节（Guan et al.，2008）。对比单一种类的凋落物，混合凋落物底物的多样性为各种不同种类型的微生物的生长和繁殖提供了更加多样化营养物质，进而提高了微生物生物量碳、氮的含量（廖利平等，2000）。研究表明针叶凋落物的C/N、木质素/N、高萜类物质和酚含量高，其在分解过程中MBC含量均相对低于阔叶凋落物（Taylor，1989；Guan et al.，2008）。

在中国，马尾松林有1001万公顷，是南方主要造林树种之一，常因林地枯落物营养差且分解缓慢而导致生产效率低，对中国南方林业的可持续发展产生了严重的影响。针叶与阔叶树种混合栽培能丰富生态系统中物种的多样性、改进凋落物化学构成，更加有效地提高和改善了林地土壤肥力、生态系统的结构与功能（樊后保等，2006；王青天，2012；陈燕艺，2014），能缓和由马尾松纯林针叶凋落物缓慢分解而致使的森林土壤肥力越来越低的状态。选择具有经济价值的阔叶乡土树种与马尾松进行混合种植不仅存活率高而且能带来一定的经济收入。然而，如何选择和搭配阔叶树种是营造混交林首先要解决的问题。养分循环和养分供应是维持人工林生态系统肥力的关键过程，研究发现营养元素循环受限是限制马尾松针叶人工纯林长期生产力的主要原因（项文化等，2002）。凋落物分解过程中的养分归还率对森林土壤肥力有很大影响（Waring et al.，1985）。因此，森林凋落物被认为是研究物种多样性与森林土壤生态系统功能关系的良好媒介。同时凋落物的养分含量和分解速率对混交林树种的选择以及人工纯林向混交林的转化也具有重要的指导意义（张晓曦等，2019；贾丙瑞，2020）。树种的种类和混栽比例的变化可以改变落叶的种类和数量对分解速率和微生物生物量具有重要影响（Wu et al.，2014）。有研究发现马尾松与具有较高N、P含量的香樟和香椿凋落物混合且占30%—40%时可增加真菌的多样性（Zhang et al.，2020）。可见针叶与高质量的阔叶混合能够提高微生物活性促进其分解，因此我们假设：马尾松针叶与高质量的阔叶凋落叶混合分解能增加微生物生物量含量，促进马尾松针叶分解。

香樟（Cinnamomumcamphora）、香椿（Toona sinensis）和檫木（Sassafrastrumu）是西南地区具有经济价值的乡土树种，前期研究已发现香樟抵抗酸性环境的能力较强，具备良好的改良土壤的作用（李志勇等，2007）。香椿因生长速度、抵抗病虫害的能力、生态适应性、食用以及药用价值等方面的出色表现而被列为中国特有的珍贵用材树种（胡薇等，2008）。檫木在混交林的营造中，与针叶杉木树种混交不光有利于维持和保护地力，促进杉木树种的生长，同时还能够形成较为良好林分结构（何贵平等，2001）。因此我们主要以四川主要的造林针叶树种马尾松和珍贵典型的乡土阔叶类树种（檫木、香樟、香椿）的凋落叶为研究材料，研究其混合分解过程中微生物生物量的变化规律，从凋落叶分解养分循环的角度，通过主要树种和伴生树种凋落物混合分解特征，筛选出养分循环高效的混交搭配树种，科学合理的提高人工林的地力长期维持，为人工林的近自然经营提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况

研究区域在四川省都江堰市灵岩山（31°01′—31°02′N，103°34′—103°36′E），该区域位于青藏高原向成都平原的过渡地带。灵岩山海拔为720—850 m是浅切割低山地貌类型。土壤为黄壤土层的厚度大概在80—110 cm之间，pH值4.5—5.5。气候类型被划分为亚热带季风湿润气候，年均气温15.2 ℃，极端最高和最低温度分别为 38 ℃和−10 ℃，年均相对湿度为81%，年平均降水量1243 mm。研究区属亚热带常绿阔叶林，区内植被种类丰富，郁闭度大致为 0.7。林分主要结构成分为乔木，包括马尾松、杉树等。林下灌木植被主要有以胡枝子（Lespedezabicolor）、野花椒（Zanthoxylum simulans）、针刺悬钩子（Rubuspungens）、光叶海桐（Pittosporumglabratum）、十大功劳（Mahonia fortunei）等为主，盖度约为10%。主要草本植物则以莎草（Cyperusrotundus）、欧洲蕨（Pteridium aguilinum）、麦冬（Ophiopogonjaponicus）、山羽藓（Thuidiumassimile）、扁竹根（Irisjaponica）、芒萁（Dranceopteisdichotome）等为主，盖度约为60%。样地概况见表1。

表1 不同样地基本概况Table 1 General characteristics in the sampling plots

1.2 试验设计

本研究基于构建生态、经济及社会效益协同以及整体服务功能较高的混交林生态系统为目标，选择香樟、檫木、香椿3个乡土树种为混交树种，根据前人研究以及中国林业混交林中主要树种与伴生树种的混合比例设置主要树种与混交树种凋落叶系列比例（8∶27∶36∶4）（方升佐，2018）。于 2016年5月，在宜宾等典型低山丘陵区收集新鲜马尾松、香樟、檫木和香椿凋落叶，自然风干，再按不同树种组合及比例混合，本研究中主要涉及了一针一阔、一针两阔和一针三阔混合模式，设置以下组合，（1）单一凋落物：纯马尾松凋落叶15 g，纯檫木凋落叶15 g，纯香樟凋落叶15 g，纯香椿凋落叶15 g。（2）一针一阔混合模式：设置3种混合比例分别为8∶2、7∶3和 6∶4（P+T、P+C 和 P+S），共 9个处理。（3）一针两阔模式：设置6种混合比例分别为8:1:1、7:2:1、7:1:2、6:3:1、6:2:2和6:1:3（P+C+T、P+S+C和P+S+T），共18个处理。（4）一针三阔模式：设置 4种比例分别为 7:1:1:1、6:2:1:1、6:1:2:1和6:1:1:2（P+S+C+T），共4个处理。最终得到不同凋落叶混合组合总计31种（表2）。凋落物袋的材质为尼龙网材质，凋落物袋分为上、下层且孔径分别为3 mm和0.04 mm，凋落物袋大小为20 cm×25 cm。野外布设样品前，测定初始凋落叶质量。将样品置于65 ℃烘箱，烘干至恒质量（48 h）后，粉碎样品并过筛（0.3 mm，60目）测定凋落叶初始质量如表3所示。2016年8月28日，在都江堰灵岩山研究区内选择地形地貌、海拔、母岩、土壤类型、坡度、坡位相同或相近并且林分密度相似的样地，设置3个30 m×30 m典型样方，将凋落物袋平铺于地表（袋间距至少2—5 cm）进行野外分解。实验处理凋落物袋的数量总计为 420袋[(4种纯凋落叶+31混合处理)×3样地×4次采样]。在每个固定样方内选择 1个凋落物袋并放置纽扣式温度记录器（iButton DS1923-F5，Maxim/Dalls Semiconductor，Sunnyvale，USA），每2小时自动记录一次数据。

表2 不同处理的详细描述Table 2 Detailed description of different treatments

表3 根据单一负指数模型计算的单一物种和混合物种凋落物的年衰变率（k），以及研究结束时（24个月）测量的剩余质量百分比Table 3 Annual decay rates (k) for the single-species and mixed-species litterbags calculated from a single negative exponential model and the measured percent mass remaining at the end of the study (24 months)

1.3 样品采集

分别于2016年11月11日，2017年5月5日，2017年11月13日，2018年5月12日采集凋落叶分解袋。每个处理收集3袋，放入冷藏箱保存带回实验室分析。同时读取记录温度数据。凋落叶分解袋手工仔细去除杂物后，一部分存储于4 ℃用于凋落叶微生物生物量测定；另一部分用于测定质量损失及pH测定。

1.4 室内分析

采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法来测定凋落叶的MBC和MBN（冉华第，2009）。凋落叶初始性质测定：C采用重铬酸氧化-硫酸亚铁滴定法测定，N用吲哚酚蓝比色法，P用磷钼黄比色法测定。木质素和纤维素是通过酸洗剂木质素法测定的（Graca et al.，2005）。缩合的单宁酸采用盐酸比色法测定（Terrill，2010），总酚含量通过Folin-Ciocalteu比色法测定（Zhou et al.，2010）。pH测定参考国标LY/T 1239—1999结合Fioretto et al.（2000）的方法（凋落叶∶水=1∶20）。

1.5 数据计算与统计分析

用重复测量方差分析（ANOVA）来分析不同混合处理间微生物生物量的差异。使用邓肯试验对平均值进行多重比较。在本研究中，预期值是指理论上混合凋落物分解下的MBC和MBN含量，而观察值是指实际分解过程中混合凋落物的 MBC和MBN含量。预期值（VP）的计算公式为：

其中，A是来自树种A凋落物的实际分解过程中微生物生物量的含量，n1是指树种A凋落物在混合凋落物中的比例；B是来自树种B凋落物的实际分解过程中微生物生物量的含量，n2是指树种B凋落物在混合落物中的比例，依此类推。微生物生物量的观察值和预期值之间的差异通过配对t检验确定。将混合效应分为加和效应（观察值和期望值之间没有显著差异）和非加性效应（观察值与期望值之间差异显著）（Mao et al.，2012）。统计显著性水平设为P＜0.05。全部的分析都是采用SPSS 25.0软件进行。采用Pearson相关性分析微生物生物量、微生物混合效应与凋落叶初始质量、pH的关系。用Origin软件作图。

2 结果分析

2.1 凋落叶初始性质、分解过程中凋落叶pH

由图1可知，凋落叶分解过程中总体上呈酸性（pH＜7），不同处理凋落叶之间平均 pH差异显著（F=3.732，P＜0.05），其中，香樟凋落叶表现出最大 pH值（6.38），其次为檫木（5.83）和香椿（5.60），马尾松（4.97）和PS82（5.03）处理最低，其它混合处理之间表现为差异无显著性。与单一马尾松凋落叶相比，马尾松与阔叶凋落叶混合后均提高了pH，阔叶能改善和缓解针叶的酸性环境。

图1 不同处理凋落叶pHFig.1 pH of litter under different mixed treatment

从表4可知，不同混合凋落叶间除纤维素无显著差异外，其余初始质量在不同混合凋落叶间均有显著差异。混合组中马尾松凋落叶占的比例越大碳、木质素、总酚以及缩合单宁含量越高，碳在PS82、PC（82和73比例）和PSC811显著最高，PT64显著最低。木质素PS82、PST811和PSC811显著最高，PT64和PCT613显著最低。总酚在PS82显著最高，PC64显著最低。缩合单宁在PS显著最高，PT64显著最低。N和P表现为混合组中马尾松凋落叶占的比例越大N、P含量越低，PT64显著最高，PS组合（82和64）显著最低。尽管不同混合凋落叶间纤维素无显著差异，纤维素仍然表现为除PSC组合外，其余混合组中马尾松凋落叶占的比例越大纤维素含量越高。可见香椿凋落叶可提高整个针阔混合凋落叶N、P初始质量且所占比例越大越显著。

表4 混合凋落叶初始质量特征Table 4 Initial litter quality characteristics of the mixed litter

2.2 不同混合处理凋落叶间的微生物生物量

方差分析结果显示，不同混合处理和不同分解时间微生物生物量碳、氮和碳氮比存在显著差异，分解时间和混合处理的交互作用对微生物生物量碳、氮和碳氮比也有显著影响（表 5）。混合凋落叶与单一凋落叶相比，所有混合处理的MBC均低于单一香椿和香樟凋落叶，而高于单一马尾松凋落叶，其中PST811、PCT712、PST712、PC组合中73和64比例最为显著。MBN表现为除PS82外的其余混合处理均显著高于单一凋落叶，PCT组合622和613比例显著最高。且马尾松凋落叶占60%的组合中的MBN均高于马尾松凋落叶占70%—80%的组合。MBC/MBN表现为除PST811外的其余混合处理均低于单一凋落叶，混合处理中PST811最高（表6）。可见与纯马尾松凋落叶相比，马尾松与阔叶混合后增加了MBC和MBN含量，尤其混合有香樟和香椿凋落叶且占较大比例时更更为显著。

表5 不同混合类型凋落叶微生物生物量碳和氮重复测量方差分析结果Table 5 Results of repeated measures ANOVA of microbial biomass carbon and nitrogen in the different mixed types of leaf litter

表6 不同处理的微生物生物量碳、氮及其比率的重复测量方差分析的多重比较结果Table 6 Results of repeated measures ANOVA and multiple comparisons(Duncan tests) of carbon, nitrogen and ratio of microbial biomass in the different treatments

2.3 凋落叶微生物生物量的混合效应

微生物生物量碳基本表现为加和效应，分解250 d后有25.81%组合表现为拮抗作用，仅PT73和PC73表现为协同作用。分解442 d时有29.03%组合表现为协同作用之后（分解604 d时）降低仅一针一阔中73和63比例表现为协同作用。MBN表现为非加和效应中协同作用，且随分解时间呈先增强后减弱的趋势，分解250 d时达最大有80.65%的处理表现出协同作用，分解604 d后仅PT、PST和PCT一部分比例表现为协同作用其余为加和效应。MBC/MBN表现为非加和效应中拮抗作用，且随分解时间呈先增强后减弱的趋势，分解250 d时达最大有90.32%的组合表现出拮抗作用，分解604 d后基本表现为加和效应。MBC在PST631、PSC712和613比例以及PSCT中香椿凋落叶占比较少时均表现出拮抗作用，PT和PS组合中73、64比例以及PC64，PCT 组合（除 8∶1∶1 和 6∶1∶3 比例）表现出协同作用。MBN在一针一阔和PCT和PST组合中马尾松凋落叶占60%—70%比例时均表现出显著的协同作用，一针三阔处理中仅 6211比例表现出显著协同作用。MBC/MBN在一针一阔中PT组合中马尾松凋落叶占60%—70%比例（除分解604 d）、以及分解75 d和250 d时的PS和PC组合，一针两阔处理中除 PST组合、PCT组合中马尾松凋落叶占70%—80%比例外的组合，以及一针三阔处理中除分解250 d时7111比例外的组合均表现出显著拮抗作用（图2）。马尾松+香椿和马尾松+檫木组合中阔叶占30%—40%、马尾松+香樟+香椿组合中7∶1∶2和 6∶2∶2比例基本表现出协同作用。拮抗作用主要出现在马尾松占较而香椿凋落叶占较小比例的组合中。

图2 微生物生物量碳、氮和碳氮比的混合效应Fig.2 Mixing effect of microbial biomass carbon, microbial biomass nitrogen and microbial biomass carbon to nitroge

2.4 微生物生物量碳、氮和碳氮比混合效应与凋落叶初始理化性质的相关性分析

微生物生物量碳混合效应仅在分解 75 d时与分解系数k值、单宁呈显著负相关性，在分解442 d时与纤维素呈显著负相关性而与C、N呈显著正相关关系，MBN混合效应在前3个分解均与k值、N、P呈显著正相关关系，与C、木质素、木质素/P呈显著负相关性。分解604 d与N、P呈显著正相关关系，与木质素/N、纤维素显著负相关性。MBC/MBN混合效应在3个分解时期均与C、木质素、木质素/N、木质素/P呈显著正相关关系，分解604 d与纤维素、木质素/N呈显著正相关关系，4个分解时期均与k值、N、P呈显著负相关性（表7）。

3 讨论

微生物的生物量能够指示凋落物分解过程中微生物的数量及其活性，凋落物中底物营养有效性和多样性对其有很大的的影响（Allen et al.，2009）。不同种类的凋落物混合后不仅提高了凋落物多样性，同时改变了基质质量和底物的可利用性，影响着微生物生物量碳、氮等（Hättenschwiler et al.，2005）。本研究发现，与纯马尾松凋落叶相比，马尾松与阔叶凋落叶混合后增加了MBC和MBN的含量。MBC在马尾松+香樟组合中6∶4和马尾松+檫木+香椿组合中7∶1∶2最为显著。MBN在马尾松+香樟+香椿组合中 6∶2∶2 和 6∶1∶3 比例显著最高，MBC/MBN在PST811最为显著，这符合我们的假设。马尾松凋落物与3种阔叶凋落物化学性质的差异可能是造成这种现象的主要原因。相关分析表明，初始凋落物性质对混合凋落物MBC和MBN呈显著的相关性（表 7）。针叶树种通常会产生化感物质，将针叶凋落物与阔叶凋落物混合不仅会降低单位内混合凋落物的化感物质，而且还为微生物提供补充营养成分（Kil et al.，1983；Gessner et al.，2010）。同时，潜在抑制剂的浓度降低支持更多的分解者生存（Barantal et al.，2011）。通过混交不同树种的凋落物来改变凋落物混合物的化学特性是调整单一人工林凋落物分解模式的关键。香椿和香樟阔叶凋落物的质量（N、P）均显著高于马尾松凋落物，而木质素、总酚等难分解物质显著最低（表4）。将针叶凋落物和高质量的香椿以及香樟阔叶凋落物混合可以改变凋落物的组成，改善凋落物的营养状况（例如氮元素），为微生物提供更有利的微环境（McTiernan et al.，1997），且阔叶所占比例越大时尤为显著。因此PC和PCT组合中香樟和香椿占比较大时微生物生物量高于其它组合。这与前人们的研究发现的具有较高质量的凋落物的土壤中的微生物生物量碳较高，低质量的凋落物则与之相反的结果是一致的（立天宇等，2015）。微生物生物量C∶N越高真菌数量越多（梁儒彪等，2015）。凋落物中木质素含量越高真菌比例就较大，因为真菌可以产生多种有效的细胞外酶降解木质素等难分解物质（Boer et al.，2005）。PST811中木质素等难分解物质含量高有利于真菌繁殖（Gessner et al.，2010），这可能是PST811处理中MBC/MBN有最大值的原因。

表7 微生物生物量碳氮和碳氮比混合效应与凋落叶初始理化性质的相关性分析Table 7 Correlation analysis between the mixed effect of MBC、MBN and MBC/MBN and the initial physical and chemical properties of litter leaves

微生物生物量碳基本表现为加和效应，少数处理在部分时期为非加和效应，在分解250 d为拮抗作用，分解442 d时为协同作用。MBN基本表现为非加和效应中协同作用，且随分解时间呈先增强后减弱的趋势。协同作用基本出现在PT、PS、PCT以及PSC721且阔叶占30%—40%的组合，混合有香椿凋落叶时尤为明显，拮抗作用基本出现在PSC和PST组合中。MBN的非加和效应均体现为显著的协同作用，且在前3个分解时期尤为显著，之后降低。MBN在一针一阔和PCT和PST组合中阔叶凋落叶占 30%—40%比例时均表现出显著的协同作用。这说明微生物生物量碳、氮对不同种类的凋落叶的混合的响应不同。前人的研究已经发现，与单一凋落物分解相比，混合凋落物的多酚氧化酶活性和微生物数量都得到显著提高。我们的研究中也发现马尾松占总质量60%的组合的k值高于马尾松占70%或80%的组合（表3，李勋未发表数据）。这说明了凋落物混合后为微生物等分解者提供更多的食物来源以及养分元素，从而促进凋落物分解（杜忠，2018）。此外有研究表明，混合物中具有较高基质质量的凋落物能吸引大量分解者定殖，而由于凋落物表面积的限制，多余的微生物可能会定殖在与其混合的凋落物上，进而加速其分解（郭鲲等，2015；Zhang et al.，2020）。香椿叶片面积大能吸引微生物等定殖，质地柔软容易被土壤动物分解从而更有益地与其他凋落物完全混合，同时N素相对丰富可能会通过淋溶被动或通过菌丝主动地转移至低质量的马尾松凋落叶，从而改变混合凋落叶层结构和养分，为微生物提供了有利的栖息地（Berglund et al.，2013；Zhang et al.，2014）。相关分析表明N、P、木质素/N与微生物生物量混合效应相关性显著（表7）。因此，在PCT和PST组合中阔叶凋落物占总质量的30%—40%时MBN观察到显著的协同作用。针叶中的凋落物中因为含有较多的树脂以及木质素等较难分解的物质，这些物质又是很难分解的并且会在分解后会产生酸性成分从而抑制微生物的活动，从而限制马尾松和檫木凋落叶占较大比例的组合中微生物对凋落叶的分解。在 PST和PSC组合中檫木和马尾松中N、P含量降低，导致混合凋落物分解缓慢表现出拮抗作用。

微生物生物量碳被认为是一种表征凋落物分解过程中活体微生物的生物量及数量的的一个直接体现（Larsen et al.，2002；周晓庆等，2011），在分解前期250 d时凋落物进入温度较低的冬季，尽管已有的研究已发现在寒冷的条件下凋落物分解过程中依然存在相对活跃的微生物（Zhu et al.，2012；周晓庆等，2011），但冬季较低的温度一定程度上会限制微生物的活性，因此在此时期实际观测MBC含量较低表现为拮抗作用。当到4、5月时温度回升提高了微生物的活性，促进了微生物等分解者对凋落叶分解，因此分解 250 d后实际观测MBC含量升高表现为协同作用。MBN一直是反映微生物在凋落物分解过程中利用 N特性的重要指标（Guan et al.，2008），而N一直都是被认为对凋落物分解的有很大影响且是最重要的影响因素之一。微生物在分解初期是必须从外部获取N源以满足自身分解的需求，凋落物的分解会因N素含量的不足而变得较慢。分解前期混合凋落叶中尤其是混合有香椿和香樟凋落叶的组合有着较高的初始养分含量如N、P等，因此混合香椿和香樟凋落叶的组合分解前期分解较快表现为协同作用，随着凋落叶分解进程的继续混合凋落叶中的阔叶凋落叶逐渐分解完全，基本只剩下木质素、总酚等难分解物质含量高的马尾松而导致混合凋落物分解缓慢，后期表现为拮抗作用。

4 结论

马尾松凋落叶与阔叶混合后增加了 MBC和MBN的含量。微生物生物量碳在大部分处理表现为加合效应，少数处理在第一年为拮抗作用第二年为协同作用。MBN的非加和效应均体现为显著的协同作用，且在前3个分解时期尤为显著之后降低。马尾松+香椿和马尾松+檫木组合中阔叶占 30%—40%、马尾松+香樟+香椿组合中 7∶1∶2 和 6∶2∶2 比例表现出协同作用。拮抗作用主要出现在马尾松占较大比例而香椿凋落叶占较小比例的组合中。综上所述，马尾松凋落叶以不同组合和比例与3种阔叶凋落叶混合后不同程度的增加了MBC和MBN含量促进了混合凋落叶的分解；与其他阔叶相比，马尾松与香椿和香樟凋落叶混合更能增加MBC和MBN的含量呈协同效应。相比于其他组合，马尾松+香樟+香椿组合中阔叶占较大比例也许更有利于增加微生物生物量，促进整个凋落叶的分解，尤其是马尾松+香樟+香椿组合中 7∶1∶2、6∶2∶2。这些结果对认识针阔混合凋落叶分解作用机制具有十分重要的意义，也为中国大面积人工纯林“混交化”的近自然改造提供技术支持。