索拉菲尼通过下调ELK-3抑制肝纤维化的进展

李天柱 崔凤姬 王文涛 斯日古楞 刘泽宇

摘 要：目的：探讨索拉菲尼与ELK-3和上皮-间质转化以及肝纤维化的关系及其作用机制。方法：Western blot检测索拉菲尼对TGF-β1诱导的肝细胞EMT细胞模型中EMT标志蛋白、ELK-3蛋白表达以及p38 MAPK蛋白的表达的影响。Masson′s trichrome染色检测索拉菲尼对肝纤维化动物组织中胶原沉积水平以及对EMT标志蛋白、α-SMA和ELK-3蛋白表达的影响。结果：索拉菲尼组处理的EMT组与EMT组相比，E-cadherin的表达水平显著升高（P<0.05），Vimentin、ELK-3蛋白表达和p38磷酸化水平均显著降低（P<0.05）。索拉菲尼灌胃的肝纤维化组与肝纤维化组相比，E-cadherin的表达水平显著升高（P<0.05），Vimentin、α-SMA和ELK-3蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。结论：索拉菲尼通过下调p38 MAPK/ELK-3抑制肝细胞的上皮-间质转化进而抑制肝纤维化的进展。

关键词：索拉菲尼;ELK-3;上皮间质转化;肝纤维化;p38

中图分类号：R575.2  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2021）04-0044-03

肝纤维化是肝炎病毒、寄生虫、酒精、药物与毒物等致病因子长期刺激导致的肝内弥漫性细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积的各种慢性疾病共同的病理变化，影响肝脏的正常生理功能，它可以发展为肝硬化甚至肝癌[1，2]。近年来，研究表明受损伤的肝细胞可通过上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition， EMT）获得肌成纤维细胞的表现型产生大量的细胞外基质促进肝纤维化[3，4]。

索拉菲尼（sorafenib）是抑制多种癌基因激酶活性的抗癌药物，是一種新型多靶点的激酶抑制剂。索拉菲尼可以通过受体酪氨酸激酶FLT-3和KIT以及Raf/MEK/ERK信号通路抑制肿瘤细胞的增殖[5]。近年来，研究发现索拉菲尼能够显著抑制TGF-β/Smad信号通路，进而抑制肝细胞EMT[6]。而且，索拉菲尼通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路减轻肝纤维化的进程[7]。

转录因子ELK-3（又称Net）是Ras-MAPK信号通路的下游靶点，在伤口愈合、血管生成和细胞迁移等过程中起着重要的作用[8]。前期研究发现，在转化生长因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）诱导的肝细胞EMT模型中， TGF-β1/p38 MAPK信号通路通过调控ELK-3诱导EMT，进而促进肝纤维化的进行[9]。而且，索拉菲尼通过调控ELK-3抑制人肝癌细胞的EMT[10]。但是，在肝纤维化过程中ELK-3与索拉菲尼相关研究尚未见报道。

本研究检测索拉菲尼对TGF-β1诱导的肝细胞EMT细胞模型中EMT标志蛋白、ELK-3蛋白表达以及p38 MAPK信号通路蛋白的表达的影响，探讨索拉菲尼与ELK-3以及上皮-间质转化的关系及其作用机制。同时，索拉菲尼对肝纤维化动物组织中胶原沉积水平，EMT标志蛋白、α-SMA和ELK-3蛋白表达的影响，探讨索拉菲尼对肝纤维化进展的影响及分子机制。

1 材料与方法

1.1 耗材和试剂

小鼠正常肝细胞株AML12细胞购自美国ATCC细胞库。DMEM/F12细胞培养液和FBS胎牛血清购自Gibco公司;四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）购自上海麦克林生化公司;索拉菲尼购自德国拜耳医药保健有限公司。

1.2 实验动物

雄性SPF级SD大鼠，共60只，体重180～200g，购自北京维通利华公司。大鼠在湿度60%、温度（23±2）℃、光照12h/12h明暗交替条件下饲养。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

小鼠正常肝细胞株AML12细胞复苏后，用DMEM/F12培养液（含青霉素100IU/mL，链霉素100IU/mL）加入10%FBS胎牛血清培养，置于37℃、5%CO2的培养箱中。

1.3.2 TGF-β1诱导的EMT细胞模型制备及索拉菲尼处理

FL83B细胞以2×105/孔接种于6孔板中，在TGF-β1处理前，FL83B细胞与含insulin-transferrin-selenium（ITS）的培养液培养48h。然后，用含有3ng/mL TGF-β1、ITS和0.5%胎牛血清的培养液处理48h，可获得EMT细胞模型。细胞实验分为3组，正常对照组、EMT组（不加索拉菲尼）和EMT+索拉菲尼组（加20μmol/L索拉菲尼）。EMT细胞模型中，处理20μmol/L索拉菲尼，培养48h后，Western blot检测ELK-3和EMT相关分子（上皮标志物E-cadherin，间质标志物Vimentin）蛋白以及MAPK信号通路蛋白表达。

1.3.3 肝纤维化动物模型制备及索拉菲尼处理

SD大鼠随机分为3组，正常对照组（Control组）、肝纤维化组（CCl4组）和肝纤维化+索拉菲尼组（CCl4+sorafenib组），20只/组。肝纤维化组和肝纤维化+索拉菲尼组大鼠给予皮下注射1.0mg/kg四氯化碳，正常对照组大鼠给予等体积的橄榄油，2次/周，共持续8周。肝纤维化+索拉菲尼组从肝纤维化造模后第三周开始每日以索拉菲尼溶液10mg/kg灌胃，连续20天。Masson's trichrome染色观察肝组织的胶原沉积水平，Western blot检测ELK-3、EMT相关分子蛋白以及α-SMA蛋白表达。

1.3.4 蛋白印迹法（Western blot）

利用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，采用BCA法测定蛋白浓度，上样30μg的蛋白质，10%SDS-PAGE电泳、PVDF转膜、10%脱脂奶粉封闭，E-cadherin抗体（1：1000）、vimentin抗体（1：1000）、α-SMA抗体（1：1000）、ELK-3抗体（1：1000）、p38抗体（1：1000）、p-p38抗体（1：1000）4℃冰箱摇床孵育过夜，HRP标记相应二抗（1：1000）37℃孵育1h，ECL显色，化学发光试剂检测蛋白相对表达量。

1.4 统计学分析

采用Sigma Plot 2000统计软件分析。数值均以x±s表示，组间比较进行t检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。所有实验重复3次。

2 结果

2.1 索拉菲尼对EMT细胞模型中EMT标志蛋白、ELK-3蛋白表达和p38磷酸化水平的影响

EMT组与正常对照组相比，EMT标志蛋白E-cadherin的表达水平显著降低（P<0.05），Vimentin、ELK-3和p-p38蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。相反，EMT+索拉菲尼组与EMT组相比，EMT标志蛋白E-cadherin的表达水平显著升高（P<0.05），Vimentin、ELK-3蛋白表达和p38磷酸化水平均显著降低（P<0.05）（图1）。

2.2 肝组织内胶原染色面积测定

肝纤维化+索拉菲尼组胶原染色面积占组织总面积的比例为2.3±0.2%，明显小于肝纤维化组4.8±0.3%（P<0.05）（图2和图3）。

2.3 索拉菲尼对肝纤维化动物组织中EMT标志蛋白、α-SMA和ELK-3蛋白表达的影响

肝纤维化组与正常对照组相比，EMT标志蛋白E-cadherin的表达水平显著降低（P<0.05），Vimentin、α-SMA和ELK-3蛋白表達水平均显著升高（P<0.05）。相反，肝纤维化+索拉菲尼组与肝纤维化组相比，EMT标志蛋白E-cadherin的表达水平显著升高（P<0.05），Vimentin、α-SMA和ELK-3蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）（图4）。

3 讨论

肝纤维化是由于肝组织内ECM过度沉积导致的病理生理过程[11，12]。研究表明，肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）是细胞外基质的主要来源，而且HSC的活化可以转化成肌成纤维细胞，是肝纤维化发生关键环节[13]。最近研究显示，肝细胞可以通过EMT获得肌成纤维细胞的表现型产生细胞外基质促进肝纤维化的进行[4]。前期研究发现，在肝细胞中TGF-β1/p38 MAPK调控ELK-3可以诱导EMT，促进肝纤维化的进行[9]。索拉菲尼最早用于治疗肝癌的靶向激酶抑制剂，对肝纤维化是否有作用目前尚无定论。近年来学者认为，索拉菲尼能减轻实验模型大鼠的肝纤维化进程[14-16]。

本实验研究结果显示，索拉菲尼通过调控p38 MAPK/ELK-3抑制肝细胞的上皮-间质转化以及抑制肝纤维化的进展。在EMT细胞模型中，索拉菲尼的处理使E-cadherin的表达水平显著升高，Vimentin、ELK-3蛋白表达和p38磷酸化水平均显著降低，提示索拉菲尼通过下调p38 MAPK/ELK-3抑制肝细胞的上皮-间质转化。在肝纤维化动物灌胃索拉菲尼使E-cadherin的表达水平显著升高，Vimentin、α-SMA和ELK-3蛋白表达水平均显著降低，提示索拉菲尼通过下调ELK-3抑制肝纤维化的进展。

综上，索拉菲尼通过下调p38 MAPK/ELK-3抑制肝细胞的上皮-间质转化进而抑制肝纤维化的进展，为肝纤维化的治疗提供新的思路。

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