关于呼和浩特市拇外翻遗传易感性分析

姜东，樊东升，王继宏

(内蒙古医科大学第二附属医院手足显微II科，内蒙古 呼和浩特 010030)

0 引言

拇外翻(hallux valgus，HV)，通常被称为大脚骨。据流行病学统计拇外翻是足部患病率较高的疾病之一，1950年Hardy和Clapham等学者在拇外翻的队列研究中发现拇外翻具有遗传倾向[1]。随后美国哈佛大学Marian T.Hannan教授也证实，拇外翻具有高度的遗传性，并强调继续探究引起拇外翻畸形的遗传易感性对于拇外翻防治的重要性[2]。近来Yi-Hsiang Hsu等学者用全基因组关联分析的方法来分析和鉴定拇外翻常见的基因变异位点，研究结果显示轴抑制蛋白2(Axis Inhibitory protein 2，AXIN2)基因的rs9675316位点变异会增加美国白种男性患拇外翻的风险，脂酶D(Esterase D，ESD)基因的rs7996797位点变异会增加美国白种女性患拇外翻的风险和马斯GPR家族3(MAS related GPR family member X3，MRGPRX3)基因的rs1563374位点变异会减低美国白种女性患拇外翻的风险，但会增加美国白种男性患拇外翻的风险[3]。

在研究其它一些疾病的遗传易感性关联分析后，我们发现在不同地域的人群中，基因的变异位点在疾病发生发展的过程中所起的作用程度不甚相同，甚至作用相反[3]。不同人群中出现的差异多研究证实为单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)。我们的研究在参考国内外类似研究的基础上，随机选取一些SNPs在中国呼和浩特市人群中进行相应的实验论证。建立地区拇外翻SNPs数据库。为地区性拇外翻畸形提供确切的预防方法及治疗手段。

1 材料与方法

1.1 样本收集

在2014年10月至2016年12月间从内蒙古医科大学第二附属医院手足显微外科和内蒙古天瑞体检中心招募各项客观条件满足我们纳入标准的拇外翻患者113名及271名健康对照人群。在详细与研究对象讲解我们的实验目的后，在口头同意的前提下，抽取每位志愿者5mL外周静脉血置于紫色美国BD公司的EDTA抗凝管中，冷冻于海尔-80摄氏度冰箱。

1.2 实验主要试剂及仪器

全血基因组DNA提取试剂盒(西安金磁纳米生物技术有限公司)：微磁粒，丝氨酸蛋白酶溶液，红细胞裂解液，白细胞裂解液，结合液BC，洗脱液ES，清洗液(BW-I，BW-II)。iPLEX® Gold试剂盒(美国Sequenom股份有限公司)：色谱纯水，PCR 缓冲液(10×)，氯化镁(25mM)，Hotstar Taq(5U/ul)，SAP缓 冲 液(10×)，SAP酶(1.7U/ul)，dNTP mix(25mM)，iPLEX 缓 冲 液(10×)，iPLEX酶，Termination mix，SpectroCLEAN树脂。

1.3 DNA提取

将事先整理好的血液样本从-80℃冰箱中取出，在常温下解冻后(若解冻后血液中有凝块需用漩涡混匀仪震荡混匀)移入50mL离心管中，遵循西安金磁公司全血DNA纯化试剂盒说明书提取全血白细胞DNA。

1.4 引物设计与定制

我们选用Sequenom MassARRY Assay Design 3.0软件对我们筛选的拇外翻SNPs进行引物及单碱基延伸引物设计。将设计好的延伸和扩增的引物序列送至上海华大基因科技有限公司进行合成。

1.5 PCR反应实验

将未经任何污染的96孔板按照实际样本数量编号。为满足每一个样本的体积和终密度相同，通过公式Ca×Va=Cb×Vb计算出单个样本应提取的体积。

将1.8μL进 口 水、0.4μL氯 化 镁、1μL Primer Mix、0.5μL 10×PCR缓冲液、0.1μL dNTP Mix及0.2μL Hotstar Taq酶混匀，制备成PCR Mix。以 4μLPCR Mix和1μLDNA为一个孔单位，依次加入384孔板，置孔板于PCR仪中。

1.6 SAP纯化反应

将1.53μL进 口 水、0.3μL SAP酶、0.17μL SAP缓 冲 液制备成SAP Mix后在漩涡混匀仪上混匀5sec，置离心机5000rpm，10sec，向PCR扩增反应后的孔板每个孔加入2μL。完成上述实验过程后，置孔板于PCR仪中。

1.7 单碱基引物延伸反应

将0.619μL进 口 水、0.2μL Termination Mix、0.041μL iPLEX酶、0.2μL iPLEX混合液(10)、0.94μL UEP Mix混匀后向孔板中每个孔加入2μL。完成上述实验过程后，置孔板于PCR仪中。

1.8 树脂纯化、点样及质谱分析

将384孔板每个空中加入纯净水16μL和树脂6mg混匀，置入离心机(4000rpm，5min)。此步反应的目的是去除反应体系中的阳性离子。用点样仪将树脂纯化后的产物(25nl)点到基因芯片上(具体操作遵循操作说明)我们选用Sequenom MassARRAY RS1000 Software[3]，对完成上述操作的基因芯片进行SNP分型。质谱仪我们选用美国Sequenom 公司生产产品。

1.9 统计学分析

我们筛选的SNPs要在健康的对照组中检测其是否满足HWE，即PHWE要大于5%。Microsoft Office Excel 2010 Software和SPSS 12.0被用于Chi-square 检验和 Fisher精确检验[4]。拇外翻的病例组和健康对照组的基因型和等位基因分布差异用Pχ2和PFisher衡量。所有获得的P值均为双侧，P＜0.05被认为有统计学意义。我们会在显性模型，隐性模型及加性模型下用比值比(Odds Ratios，OR)和95%可信区间(Confidence Intervals，CI)评估每一个SNP和拇外翻的患病风险。年龄和性别信息被用来进行校正[5]。

2 结果

2.1 样本的临床资料

我们共收集的113名拇外翻患者的血样和271名健康对照人群的血样。拇外翻组的平均年龄是48.7岁，健康对照组的平均年龄是49.3岁，两组经过Chi-square检验，P值小于0.05，有统计学差异。病例组中有男性13名，女性100名，对照组中有男性98名，女性173名，经过Chi-square 检验，P值小于0.05，有统计学差异。详细信息见表1。

表1 拇外翻病人和对照的基本信息

2.2 Chi-square分析结果

我们共选择了21个SNP基因分型，其中rs28628238和rs1563374的基因型单一，故这两个位点的运算结果都没有意义。位于ESD基因上的rs7996797在等位基因的模型下与我们的对照组存在差异P＜0.05。在等位基因模型下13号染色体上的rs7996797的最小等位基因“G”，OR=1.36，95%CI=1.03-1.94，P=0.04，如表2显示了我们筛选的21个SNPs基本信息。

表2 候选基因位点的基本信息

2.3 逻辑回归分型结果

我们所测得数据经逻辑回归分析，并用性别和年龄校正后发现，在AIC和BIC最小值时，ESD基因rs1923880在隐性模型下能增加拇外翻发病的风险(OR=2.08，95%CI=1.05-4.11，P=0.038)，AXIN2基因rs9915936在隐性模型下能增加拇外翻发病的风险(OR=3.28，95%CI=1.06-10.19，P=0.038)，见表3、4。

表3 1rs1923880位点与拇外翻风险的相关关系

3 讨论

AXIN2基因位于17号染色体，根据相关文献报道该基因能抑制细胞增殖和抑制成骨细胞的分化，进而干扰骨组织的正常代谢。AXIN2基因编码的主骨架蛋白在Wnt/β-catenin信号通路和TGF-β信号通路参与骨骼的发育[3]，在Wnt信号缺失时，AXIN2会结合GSK-3β和β-连环蛋白，促进在GSK-3β介导下的β-连环蛋白磷酸化，诱导蛋白的泛素化和蛋白酶体的降解[4]。当β-连环蛋白磷酸化时，AXIN2蛋白就会保持稳定。当 Wnt信号存在时，AXIN2会与LRP5/LRP6结合后去磷酸化。包含AXIN2在内形成的蛋白复合物是不稳定的，因此当β-连环蛋白积累到一定数量后被转移到细胞核内，通过TCF和LEF转录因子调节基因的转录[3]。Debbie Y.Dao等学者在敲除掉 AXIN2基因的小鼠体内发现，AXIN2基因在小鼠骨骼发育过程中扮演着十分重要的角色[5-8]。美国纽约罗切斯特大学医学院学者Ying Yan和他的团队在研究成年鼠的Wnt-β-连环蛋白信号时发现AXIN2在成年小鼠骨骼重建的过程中起着非常关键的负调节作用，而且还能通过调节β-连环蛋白-BMP2/4-Osx信号通路参与成骨细胞分化[9]。在2016年美国斯坦福大学的Ransom教授也在研究中发现小鼠骨骼受损后AXIN2-Wnt-β-连环蛋白通路会被激活，参与骨骼的修复与重建[6]。我们实验结果也证实AXIN2基因的突变会增加拇外翻的患病风险，这与Yi-Hsiang Hsu学者研究的结果一致[3]。rs9915936位于基因的编码区，该位点的突变影响蛋白质的空间结构，以至于最终影响AXIN2蛋白质的功能，进而使Wnt/β-catenin信号通路发生紊乱，导致骨组织代谢的失调，诱发拇外翻的形成。目前，具体的病理机制和过程还需要我们进一步研究。

表4 rs9915936位点与拇外翻风险的相关关系

ESD基因编码一种丝氨酸水解酶，参与唾液酸的回收与利用[11]。但增加血清唾液酸水平会引起原发性骨关节炎患者抗氧化水平降低[12]。研究证实拇外翻与ESD基因有关联，拇外翻的形成与原发性骨关节炎所引起的第一跖趾关节功能异常有关，所以由ESD基因相关的拇外翻形成的机制可能与原发性骨关节炎相似[3]。rs1923880位于ESD基因的内区，该位点的A到G的变异增加了拇外翻的发病风险，其原因可能是在遗传信息转录后在剪切的过程受到影响，进而使ESD基因表达异常。我们的实验结果和美国的Josephine Hoh教授的GWAS结果相同，进一步证明rs1923880位点的变异与拇外翻风险的相关性[13,14]。

虽然我们在MRGPRX3基因、AXIN1基因和BBS9基因所筛选的SNPs没有显示出与拇外翻的关联性，但是由于我们的实验样本的限制，并不能证明它们之间就没有相关性。

MRGPRX3蛋白是MAS相关/ G蛋白偶联受体的感觉神经元特异性亚家族，当前人们对MRGPRX3基因研究甚少，在2005年该基因被日本Kaisho教授首次报道，证明该基因的过表达将导致转基因小鼠发生白内障和皮肤病[15]。最新的研究表明该基因编码的蛋白可能参与了感觉神经元的调节和痛觉和/或瘙痒的调节[3]，以及该基因某个位点的变异将会导致拇外翻的发生[16]。目前该基因的功能上不完全清楚，仅仅根据Yi-Hsiang Hsu学者的研究，猜测该基因可能与骨骼代谢有关。

AXIN1蛋白也叫膜联蛋白I，属于Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，是合成有效的炎性介质、前列腺素及白三烯所必须的蛋白之一，AXIN1蛋白可能有潜在的抗炎活性。炎症众所周知的与原发性骨关节炎相关[17]。Yi-Hsiang Hsu学者也证实AXIN1基因的中的SNPs会增加女性患拇外翻的风险[3]。其与AXIN2基因共同参与Wnt/β-catenin信号通路和TGF-β信号通路，影响拇外翻发生和发展的过程相类似。

BBS9基因位于7号基因编码链上长度约为476.82kb，从33168857到33645680，根据目前Pubmed所有关于BBS6基因研究成果显示，成骨细胞中的甲状旁腺激素会下调该基因的表达，因此被认为其参与甲状旁腺激素在骨骼中的代谢，但目前该基因功能尚未确定(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research)。根据美国国家人类基因研究所的GWAS研究显示，BBS9基因的易感位点和新生儿的颅骨矢状缝闭合时间具有密切的相关性，这表明BBS9基因可能在骨骼发育中发挥重要的作用[18]。另外BBS9基因对于拇外翻的影响可能与足部骨骼和周围的软组织受到的长期复杂的过程有关[3]。

我们的实验采用的候选基因的策略，共筛选了21个SNPs在中国呼和浩特汉族人群中进行验证，探究了不同人群相关SNPs与拇外翻易感人群上的差异。通过我们的实验研究，可以得到以下结论：

(1)ESD基因和AXIN2基因可能与呼和浩特人群拇外翻的发病风险有关。

(2)ESD基因中的单体型“G”比野生单体型增加拇外翻的风险。