KG-1a/NSG移植性急性髓系白血病小鼠模型的构建及其鉴定

李渊，顾守美，刘小虎，周雯，周玥*，毕玉洮，郭太兵

(1.大理护理职业学院，云南 大理 671000；2.大理大学第一附属医院 呼吸内科，云南 大理 671000；3.大理大学 组织胚胎学教研室，云南省细胞生物学重点实验室，云南 大理 671000)

0 引言

急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia，AML)是一种起源于AML干细胞的以髓细胞失控性增殖为特征的危及生命的恶性克隆性疾病，急性髓系白血病克隆中的白血病细胞增值失控、分化障碍、凋亡受阻，而停滞在细胞发育的不同阶段，发病时骨髓中异常的原始细胞及幼稚细胞(白血病细胞)大量增殖并浸润肝、脾、淋巴结等各种脏器，抑制正常造血，具有高度异质性[1]。AML的临床进展和预后与侵袭细胞类型、遗传学改变以及克隆的生物学特性紧密相关。尽管随着化疗方案的不断改进，患者的治疗效果已有明显改善，但复发及大剂量化疗的毒副作用仍是影响疗效进一步提高的主要障碍[2]。本研究通过免疫磁珠分选法分离纯化出CD34+CD38-KG-1a细胞，移植入NSG小鼠体内，复制急性髓系白血病小鼠模型，为进一步研究白血病的发生机制及治疗奠定了基础。

1 材料

1.1 动物

雌性NSG小鼠24只，10-12周龄，体质量25～30g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司。在符合SPF标准的层流室中饲养。

1.2 细胞株

KG-1a细胞为重庆医科大学干细胞与组织工程研究室馈赠。

1.3 药品与试剂

IMDM1640细胞培养液(Gibco公司)；胎牛血清(Gibco公司)；Human anti-CD38 MicroBead Kit(APC)(Miltenyi公司)；Human anti-CD34 MicroBead Kit(FITC)(Miltenyi公司)；环磷酰胺水合物试剂(Sigma公司)；CCK-8试剂盒(Sigma公司)；瑞氏染液试剂一、二(南京建成公司)；Anti CD34抗体(abcam公司)；无水乙醇(国医药集团有限公司)；免疫荧光一、二抗稀释液(碧云天公司)；山羊血清(上海生工公司)；Dapi染色液、苏木素染液、伊红染液、抗荧光淬灭剂(碧云天公司)；台盼蓝染料(Sigma公司)。

1.4 仪器

超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；MC-6500血常规仪(库贝尔生物科技有限公司)；倒置显微镜(OLYMPUS公司)；二氧化碳培养箱(三洋公司)；切片机、烤片机(德国Leica公司)；电子分析天平(瑞士Precisa12A公司)；激光共聚焦荧光显微镜(徕卡显微系统有限公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；多功能酶标仪(Thermo Fisher公司)；移液器(德国Eppendorf公司)；细胞计数板(上海求精仪器公司)；细胞培养瓶及细胞培养板(Costar公司)。

2 方法

2.1 CD34+CD38-KG-1a细胞的分离纯化及鉴定

2.1.1 CD34+CD38-KG-1a细胞的分离纯化

通过免疫磁珠分选法对KG-1a细胞进行分离纯化，洗下的细胞即为CD34+CD38-KG-1a细胞。

2.1.2 CD34+CD38-KG-1a细胞活性检测

将适量的CD34+CD38-KG-1a细胞悬液与台盼蓝溶液混合均匀，滴加至载玻片上，显微镜下进行观察及计数。

2.1.3 CD34+CD38-KG-1a细胞纯度检测

分别取分选前的KG-1a细胞和分选后的CD34+CD38-KG-1a细胞1×106个，加入单克隆抗体human anti-CD34-FITC和human anti-CD38-APC，通过流式细胞仪检测APC和FITC的荧光信号。细胞纯度(%)=(CD34+CD38-细胞数/细胞总数)×100。

2.2 实验分组

将NSG小鼠随机分为对照组、实验组，每组12只。在细胞移植前给予小鼠腹腔注射环磷酰胺2 mg/只，连续2天；环磷酰胺注射后第3天，实验组：在无菌条件下通过尾静脉移植CD34+CD38-KG-1a细胞，细胞量为3×107个/只；对照组：相同条件下尾静脉注入等量等时的无菌PBS。

2.3 NSG小鼠的一般情况观察

实验期间按照4次/周观察小鼠的精神状况、食欲状态、活动能力、毛发状况、腹部肿块、体质量等情况，并做好实验记录。

2.4 NSG小鼠血涂片分析

制备血涂片，瑞氏-吉姆萨染色，待干后即可镜检，中性树胶封固。

2.5 NSG小鼠骨髓象分析

取NSG小鼠双侧股骨分离出骨髓并制备骨髓涂片。瑞氏-吉姆萨染色，待干后即可镜检，中性树胶封固。

2.6 肝脏、脾脏病理学检测

第40天处死小鼠后取新鲜肝脏及脾脏，甲醛固定后，进行组织石蜡包埋，冷冻切片后染色，95%乙醇依次脱水后二甲苯依次透明，晾干后即可镜检和封片。

2.7 CCK-8检测两组骨髓细胞的增值能力

提取的各组模型骨髓细胞，计数调整细胞浓度至1×105/mL。分别接种于96孔板中，每孔100 μL，每组细胞设3个复孔。将96孔板移入培养箱中培养(37℃，5% CO2)，培养24h、48h、96h。每孔加入10μL CCK-8溶液，于培养箱内孵育1-4h。用酶标仪测定在450nm处的吸光度值。同时设置空白孔(只加培养基和CCK溶液)，对照孔(未经处理的细胞、培养基、CCK溶液)。依据下列公式计算骨髓细胞的活力。

细胞增殖活力(%)=[OD实验组-OD空白组]/[OD对照组-OD空白组] ×100%

2.8 免疫荧光染色鉴定肿瘤细胞来源

在培养板中将已制备完成的细胞爬片用PBS浸洗3次，4%的多聚甲醛常温固定15min，PBS浸洗后用0.5%的Triton x-100通透细胞15min，滴加6%正常山羊血清室温封闭30min，滴加一抗Anti CD34(稀释比例为1:500)湿盒中4℃孵育过夜，复温后滴加荧光二抗Anti Alexa Fluor 647(稀释比例：1:800)湿盒中37℃孵育30min；PBS浸洗后滴加DAPI避光孵育5min对标本进行染核，PBS浸洗后用含抗荧光淬灭剂封片，激光扫描聚焦显微镜下观察采集图像。

2.9 统计学处理

运用SPSS 17.0 软件对数据进行统计学分析，采用析因设计、单因素方差分析方法，数据均以表示，P＜0.05有统计学意义。

3 结果

3.1 CD34+CD38-KG-1a细胞的纯度与活性

测定结果显示，分选前细胞中CD34+CD38-KG-1a细胞群百分比为(8.25±1.55)%，免疫磁珠分选后CD34+CD38-KG-1a细胞群纯度可达(92.45±2.80)%。台盼蓝染色测定结果显示，免疫磁珠分选后细胞活性为(93.68±1.97)%。提示通过免疫磁珠分选法分选得到的CD34+CD38-KG-1a细胞有较高的纯度和活性。

3.2 NSG小鼠一般情况观察

与对照组小鼠比较，实验组小鼠神态萎靡不振、行走不稳、毛发杂乱，皮肤粗糙，4只小鼠腹部有明显肿块，体质量明显低于对照组(P＜0.05)；对照组小鼠表现正常，均未出现白血病征象。见表1。

表1 两组小鼠平均体质量(n=12，

表1 两组小鼠平均体质量(n=12，

注：与对照组相比: *P＜0.05(表2同)。

组别 平均体质量(g)对照组 26.85±1.96实验组 18.45±2.65*

3.3 两组小鼠血涂片分析

血涂片结果显示，与对照组相比较，实验组可见白血病细胞。见图1。

图1 两组小鼠血涂片分析（Wright-Giemsa染色）

3.4 两组小鼠骨髓象分析

骨髓涂片结果显示，与对照组相比较，实验组小鼠骨髓异常增生活跃，可见大量白血病细胞浸润，胞质染色呈嗜碱性。见图2。

图2 两组小鼠骨髓象分析（Wright-Giemsa染色）

3.5 两组小鼠肝脏、脾脏病理学检测

与对照组相比，模型组小鼠肝小叶结构被破坏，边界不清，肝脏组织中大量白血病细胞浸润，肝细胞出现水样变性；脾脏中的淋巴滤泡扩大并融合成片，脾脏组织中有大量白血病细胞浸润。对照组结构正常。见图3、4。

图3 两组小鼠肝脏病理学检测（HE染色）

3.6 两组小鼠骨髓细胞增值能力检测

与对照组相比，实验组小鼠骨髓细胞的增值活力明显增高(P＜0.05)。见表2。

表2 两组小鼠骨髓细胞增值能力的检测(n=12，

表2 两组小鼠骨髓细胞增值能力的检测(n=12，

组别 细胞活力(%)对照组 92.15±2.58实验组 129.12±1.45*

3.7 免疫荧光鉴定骨髓肿瘤细胞来源

免疫荧光检测结果显示，实验组骨髓细胞荧光明亮且清晰，出现明显阳性表达，提示实验组小鼠骨髓细胞中大量人源白血病细胞。见图5。

图5 免疫荧光鉴定两组小鼠骨髓中白血病细胞

4 讨论

图4 两组小鼠脾脏病理学检测（HE染色）

急性髓系白血病是一种高发死亡性的恶性血液肿瘤，目前治疗白血病的方法主要有化学药物治疗、放射治疗、骨髓移植治疗、免疫治疗以及靶向性药物治疗等[3]。虽然取得了较好的效果，但是由于机制研究方面的缺乏，失败的案例也不在少数。“探其根源，寻其究竟”，只有从根本上研究白血病的发病机制，才能更好的治疗白血病。在动物模型基础上研究白血病的发病机制和治疗方案的优化选择是治疗白血病的前提。

急性髓系白血病在人体内的机制十分复杂，若以人为实验对象，受到多层因素的限制。建立急性髓系白血病动物模型，能够迅速挖掘其发生机制，为临床治疗白血病提供新思路。目前多数研究表明，急性髓系白血病的反复发作，是由于患者体内的白血病干细胞未被清除彻底而引起的，采用免疫磁珠分选法将KG-1a细胞的CD34+CD38-亚群分离出来，移植入动物体内可构建模型已被逐步证实[4]。本研究结果显示，采用免疫磁珠分选后CD34+CD38-KG-1a细胞群纯度可高达(92.45±2.80)%，活性高达(93.68±1.97)%。

NSG是在NOD-SCID小鼠(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)基础上利用对Rag2和IL2rg双基因敲除，获得严重免疫缺陷小鼠，是异种移植的重要载体，对于研究人类造血干细胞、肿瘤发生与治疗、免疫缺陷疾病与体内免疫机制研究都具有重要意义；与 NOD/SCID小鼠相比，NSG小鼠的人体细胞和组织移植存活率显著提高，同时能够植入更高比例的正常或癌变人类细胞和组织[5-8]。

本研究通过尾静脉移植CD34+CD38-KG-1a细胞来构建NSG小鼠急性髓系白血病模型，与对照组相比，实验组小鼠神态萎靡不振、行走不稳、毛发杂乱，皮肤粗糙，体质量明显低于对照组；小鼠骨髓异常增生活跃，可见大量白血病细胞浸润；肝、脾脏结构被破坏；细胞免疫荧光检测提示小鼠骨髓细胞中大量人源白血病细胞。据此，通过尾静脉移植CD34+CD38-KG-1a细胞可成功构建KG-1a/NSG急性髓系白血病小鼠模型，为进一步研究白血病提供了有力的支持。