甘薯可食用部位绿原酸合成及相关基因表达特征分析

禹 阳，林 欢，王云鹏，马佩勇，贾赵东，谢一芝，边小峰

(1. 江苏省农业科学院 粮食作物研究所，南京 210014；2. 淮阴工学院 生命科学与食品工程学院，江苏淮安 223003)

在中国，甘薯作为仅次于水稻、小麦和玉米的主要粮食作物，不仅富含人们日常所需的各种营养成分，还含有大量功能性成分，如绿原酸(Chlorogenic acid，CGA)、黄酮类、脱氢表雄酮等[1]。

绿原酸是植物苯丙素类次生代谢产物之一，具有多种生物活性，如抗氧化、抗病毒、抑菌、调节糖脂代谢等[2-4]。狭义上，绿原酸指由咖啡酸(Caffeic acid)与奎宁酸(Quinic acid)组成的咖啡单宁酸(5-O-Caffeoylquinic acid)[5]。绿原酸在植物中通常以多种异构体形式共存，因此广义上的绿原酸系指由奎宁酸与反式肉桂酸(trans-Cinnamic acids)缩合而成的酯类化合物家族，常见的反式肉桂酸有咖啡酸、p-香豆酸(p-Coumaric acid)和阿魏酸(Ferulic acid)[6-7]。甘薯可食用部位中均含有绿原酸，包括叶、茎、叶柄及储藏根，其中叶中含量较高[8-9]。

目前，已报道的绿原酸合成途径在不同植物间存在一定差异，但基本包括苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanin ammonia-lyase，PAL)、肉桂酰-4-羟化酶(Cinnidine-4-hydroxylase，C4H)、4-羟基桂皮酰辅酶A连接酶(4-coumaroyl-CoA-ligase，4CL)、羟基桂皮酰辅酶A莽草酸/奎尼酸羟基桂皮酰转移酶(Hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase，HCT)、香豆酸羟基化酶(p-Coumarate3-hydroxylase，C3H)、羟基桂皮酰辅酶A奎尼酸羟基转移酶(Hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase，HQT)和UDP葡萄糖肉桂酸葡萄糖基转移酶(UDP glucose: cinnamate glucosyl transferase，UGCT)等关键酶基因[10]。

有关甘薯绿原酸的研究多集中于其提取和生物活性，对其合成调控尚未见报道，其合成过程中参与的重要酶、关键基因和调控因子都急需分析研究。基于转录组分析及同源克隆，Yu等[11]已从甘薯栽培种(‘苏薯16号’，由江苏省农业科学院选育)中分离克隆了部分甘薯绿原酸合成途径相关酶基因。基于此，本研究以6种不同类型甘薯品种为材料，通过分析不同甘薯品种可食用部位中绿原酸含量和合成途径相关基因的表达差异，探讨甘薯可食用部位中绿原酸合成与相关基因组织表达的关系，为培育高绿原酸含量甘薯品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与样品准备

供试品种包括3个叶菜用型甘薯品种‘福薯7-6’(Fushu 7-6，F7-6)‘福菜薯18号’(Fucaishu No.18，FC18)及‘宁菜薯1号’(Ningcaishu No.1，NC1)和3个鲜食型甘薯品种‘苏薯16号’(Sushu No.16，S16)‘宁紫薯1号’(Ningzishu No.1，NZ1)及‘宁紫薯4号’(Ningzishu No.4，NZ4)(表1)。

表1 6个供试品种概况Table 1 Six tested-cultivars

试验材料于2018年5月28日在江苏省农业科学院试验地栽插，种植和田间管理按常规方法进行。每品种3行，每行10株，行株距为 80 cm×25 cm。绿原酸含量测定样品采集：于8月1日地上茎叶封垄后采收茎尖(第5片完全叶以上部位)，10月25日收获储藏根。选取长势一致、无病虫害的茎尖和储藏根为试验材料，105 ℃杀青30 min，65 ℃烘干后粉碎，过40目筛后密封低温保存备用。基因表达分析样品采集：于8月1日每品种随机选取5株长势一致、无病虫害的植株，分别采取茎尖(第5片完全叶以上部位，Stem-apex)和储藏根(Storage root)，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱，备用。

1.2 甘薯绿原酸提取及测定

1.2.1 绿原酸标准曲线的绘制 绿原酸标准品购于Sigma公司，准确称取5.00 mg，加50%甲醇超声溶解定容于50 mL容量瓶。制成的标准液经紫外分光光度计200～400 nm波长扫描，得到绿原酸的最大吸收峰327 nm。将0.1 mg/mL的绿原酸标准品溶液分别稀释成1,2,5,10,20 μg/mL，在吸收光波长327 nm处测定其吸光度。以标准液浓度(mg/mL)为横坐标x，吸光值为纵坐标y，作出绿原酸标准曲线：y= 59.411x+ 0.023(R2=0.995 6)。

1.2.2 样品绿原酸含量的测定 参照前人报道的甘薯绿原酸提取方法[12-13]，并进行部分改善，具体操作如下：称取0.2 g样品干粉置于具塞锥形瓶中，加50%甲醇20 mL，浸提24 h后50 ℃超声30 min，0.45 μm有机滤膜抽滤，滤液另存于50 mL具塞容量瓶中，滤渣加50%甲醇20 mL，重复超声30 min并抽滤。合并两次滤液，用50%甲醇定容后放于冰箱内待用。取待测液3 mL并稀释10倍，平行制备3 次，在327 nm处测定提取液吸光值，平行进样3次。根据标准曲线计算样品提取液浓度，按下式计算绿原酸含量：

绿原酸含量=(x×10×V×10-3)/m×100%

x代表样品提取液浓度(mg/mL)；10为稀释倍数；V代表样品提取液定容体积(50 mL)；m代表样品质量(g)。

1.3 样品总RNA提取及cDNA第一链合成

使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒(北京天根)提取总RNA后，用NanoDrop 2000紫外-可见分光光度计(Thermo Fisher USA)检测RNA浓度及质量，1%琼脂糖电泳检测RNA完整性。所有样品提取的总RNA OD260nm/OD230nm值为1.9～2.1，OD260nm/OD280nm为1.9～2.0，质量浓度为360～650 ng/μL，且28S、18S带型整齐，无拖尾。取1 μg RNA作为模板，使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)反转录合成第一链cDNA， -20 ℃保存。

1.4 引物设计

根据NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)已提交的甘薯绿原酸合成相关酶基因的cDNA序列，IbPAL1(GenBank：MN823653)、IbPAL2(GenBank：D78640.1)、IbC4H(GenBank：GQ373157.2)、Ib4CL(GenBank：AB469557.1)、IbHCT(GenBank：AB035183.1)、IbC3H(GenBank：MT792533)、IbHQT(GenBank：AB576769.1)和IbUGCT(GenBank：AB909370.1)，利用GenScript网站(https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool)在线设计qRT-PCR引物[11]。引物片段长度80～150 bp，Tm值52～ 60 ℃，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列见表2。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Gene-specific primers used for gene expression analysis

1.5 甘薯绿原酸合成途径相关基因qRT-PCR分析

将反转录合成的cDNA稀释5倍后作为模板，利用SYBR premix Ex TaqTM(TaKaRa)试剂盒，在ABI StepOnePlus上扩增进行qRT-PCR反应。扩增程序为: 95 ℃ 60 s 预变性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，40个循环；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min。qRT-PCR反应所得的扩增曲线均呈“S”形，循环阈值处于扩增曲线的对数期，溶解曲线均表现为单峰。以IbTublin基因的表达量作为内参，计算出目的基因的相对表达量。样本和内参分别设3次重复。

1.6 数据统计分析

甘薯绿原酸合成酶基因的相对表达量计算采用2-△△CT法[14]。采用SPSS 19.0进行统计分析(P<0.05为显著水平)。

2 结果与分析

2.1 不同类型甘薯品种可食用部位绿原酸含量变化

结果表明(图1)，6个品种的茎尖绿原酸含量均高于其储藏根中的，茎尖中绿原酸含量平均为1.248%，储藏根中平均为0.281%，差异极显著。同一类型甘薯品种之间，茎尖中绿原酸含量高的品种其储藏根中含量相对较低：如在叶菜用型甘薯品种中，‘宁菜薯1号’的茎尖绿原酸含量最高，但其储藏根中的最低；鲜食型甘薯品种中结果与此类似。

相同部位绿原酸含量在不同品种之间差异显著，‘宁紫薯4号’的储藏根中绿原酸含量最高，而‘苏薯16号’的茎尖富含更多绿原酸。此外，无论在茎尖还是储藏根，3个鲜食型甘薯的平均绿原酸含量均高于3个叶菜用型的：前者茎尖和储藏根平均绿原酸含量分别为1.437%和0.413%；而后者的则分别为1.118%和0.150%。

2.2 甘薯绿原酸合成途径基因在不同甘薯品种中的组织表达模式分析

在3个叶菜用型甘薯品种中，绿原酸合成相关基因均富集于茎尖表达，尤其是‘福菜薯18号’和‘福薯7-6’(图2-A～C)。鲜食型品种中部分酶基因的表达模式出现差异：‘苏薯16号’中Ib4CL相对在其储藏根中高表达，IbC4H、IbHQT和IbUGCT虽在茎尖相对表达略高，但与储藏根并无明显差异(图2-D)；‘宁紫薯1号’中IbUGCT在储藏根中的表达量显著高于茎尖，除Ib4CL、IbHCT和IbC3H高表达于茎尖外，其他酶基因在茎尖和储藏根中的表达差异不显著(图2-E)；‘宁紫薯4号’中IbPAL2不同于其他酶基因，在储藏根中的表达水平明显高于茎尖(图2-F)。此结果说明，不同品种可食用部位中绿原酸含量的差异可能与其合成相关酶基因的组织特异性表达有关。

3 讨论与结论

本研究通过对国内6个甘薯品种可食用部位的绿原酸含量进行分析发现，甘薯茎尖绿原酸含量比储藏根中更高，此结果与之前相关报道一致[15-16]。绿原酸含量在不同甘薯品种之间存在显著差异，值得注意是，与国内叶菜用甘薯主推品种之一的‘福菜薯18号’相比，叶菜用型品种‘宁菜薯1号’和鲜食型品种‘苏薯16号’‘宁紫薯1号’的茎尖绿原酸含量水平均较高。此外，作为兼含花青素和胡萝卜素的新型紫甘薯品种[17]，‘宁紫薯4号’储藏根中的绿原酸含量在参试品种中居最高。

目前关于植物绿原酸的生物合成已有许多报道[18-21]，从不同植物中克隆鉴定出了一些相关酶基因。研究表明，绿原酸合成途径相关酶基因的表达水平会影响绿原酸合成[11,22-25]。本研究对8个甘薯绿原酸合成途径相关酶基因在6个不同甘薯品种中的组织表达模式分别进行了分析，结果表明甘薯中绿原酸合成相关酶基因大多集中于茎尖表达，该结果与绿原酸在甘薯茎尖中含量较高相一致。同时，区别于3个叶菜用型品种，部分酶基因在3个鲜食型品种的组织表达差异较小，甚至集中于储藏根表达。尤其在‘宁紫薯4号’中，IbPAL2在其储藏根中的相对表达量显著高于茎尖，可能与‘宁紫薯4号’储藏根中绿原酸含量较高有关。这些结果说明，绿原酸合成途径相关酶基因的组织表达特征很大程度上决定绿原酸在甘薯可食用部位中的积累，但具体的酶基因功能及其机制还有待于进一步研究。