红三叶异黄酮在刈割6 h内的变化规律

冯纪铭，何春燕，刘 权，齐 开，莫海凤

(兰州大学 草地农业科技学院，兰州大学草业科学国家级实验教学中心，兰州 730020)

刈割是牧草常见的生产方式，能有效提高单位面积牧草产量，但会对植物体造成机械伤害，导致植物体内氧自由基的大量增加，造成膜脂过氧化，影响植物生长[1-3]。牧草在受到外界干扰的情况下具有补偿性和均衡性生长的特性，刈割正是通过牧草的这一特性来提高牧草产量[4-5]，因此，刈割管理需寻求外界干扰和自我补偿的平衡点。针对不同牧草、不同种植区域，此前开展了大量关于刈割时期、频次与强度等因素对牧草产量和品质影响的研究。研究结果表明，适当刈割能够提高牧草生产力，且可以通过提升牧草中粗蛋白和粗灰分含量，降低酸性洗涤纤维含量，改善牧草品质[6-7]。植物体能够通过调节其生理生化物质含量及活性，清除体内的过量自由基，维持其正常的生命活动。然而，当前关于牧草在受到刈割后短时间内生理生化指标的变化及其再生机理的研究相对较少。

红三叶(TrifoliumpratenseL.)为优良的豆科牧草[8]，在世界范围内广泛种植。其植物体中含有大量的异黄酮类化合物[9]，被用于治疗女性更年期综合症[10]、缓解抑郁焦虑情绪[11]；作为饲料，可以促进家畜的生长，提高家畜的屠宰性能，提高家畜产品的品质[12-13]。红三叶中异黄酮类化合物主要为鹰嘴豆素A、芒柄花素、染料木素和大豆苷元[14-15]，具有良好的抗氧化活性，能够清除氧自由基[16-17]，是植物抗逆过程中的物质基础。此外，异黄酮类化合物是该植物群落的竞争武器，具有植物毒活性，对红三叶的生态竞争具有重要作用[18]。

当前，刈割方面的研究主要集中在刈割频次、留茬高度与产量的关系。有研究表明，在豆禾混播草地中，禾草混播比例75%、施氮肥和磷肥均为0.15t/hm2、每年刈割3次的产量最高[19]。在红三叶和黑麦草混播草地中，红三叶产量变化明显，且其变化主导总产量的变化，相对较低的留茬和较高的刈割频次均使得红三叶产量增加[20]，在红三叶与鸭茅的混播草地中的研究结论与之相同[21]。因此，当前关于红三叶刈割的研究主要基于草地生产力，关于红三叶刈割后短时间内应激机理的研究还未见报道。

本研究以‘炫丽’(T.pratensecv. ‘Brilliant’)和‘海发’(T.pratensecv.‘Haifa’) 红三叶为研究对象，进行间隔3h的3次连续刈割，通过分析异黄酮总含量及4种异黄酮类化合物含量随刈割次数的变化情况，研究在6h内红三叶植物体内异黄酮含量响应刈割刺激的变化规律，为生产中以异黄酮生产为目的红三叶收获方式提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

‘海发’和‘炫丽’红三叶种植于兰州大学榆中校区智能温室，在初花期对其进行刈割。红三叶在盛花期代谢旺盛，异黄酮含量较高[8]，但叶量下降极为明显，因此本试验参考生产实际，选择在初花期进行刈割[22]。

第1次刈割保留地上20 cm，第2次刈割保留地上5 cm，第3次齐地刈割，每次刈割间隔3 h，3个重复。刈割所得地上部分分离茎秆和叶片，其中第3 次刈割仅得茎秆部分。所得样品在60 ℃下烘干，粉碎，备用。第1 次刈割收集的样品为植物处于未受到刈割的状态，并以此作为后2 次刈割处理的对照。

1.2 方 法

1.2.1 异黄酮总含量测定 取11.9 mg芒柄花素溶于10 mL体积分数70%的乙醇，取0.5 mL稀释至10 mL，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、2.0、3.0 mL于9个10 mL容量瓶中，定容，用紫外分光光度计测定275 nm处吸光值，得回归方程：y=19.487x+0.0159，R2=0.999 5，x表示异黄酮溶液浓度，y表示吸光度值。

分别取0.1 g 3 次刈割所得茎秆、叶片的试样于离心管中，加体积分数40%的乙醇10 mL，50 ℃超声萃取30 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液0.3 mL于10 mL容量瓶，用体积分数70%的乙醇定容，测定275 nm处吸光值，代入线性回归方程，计算异黄酮总含量。

1.2.2 异黄酮类化合物含量测定 液相色谱为Agilent 1000 LC(Santa Clara, CA, USA)，VWD检测器，反相 C18 柱(颗粒粒径为 5 μm， 4.6 mm×250 mm，美国)，柱温 30 ℃。流动相：A 相为体积分数0.1%的乙酸水，B 相为色谱甲醇，流速 0.6 mL/min；检测波长275 nm，进样量 20.0 μL。洗脱程序为：0～5 min，40% B；10～ 20 min，70% B；35 min，85% B； 40 min，100% B。分别制备4个标准品在质量浓度为0～0.5 mg/mL的标准曲线。

试验数据以3个重复的“平均值±标准差”表示，用SPSS 24.0进行成对样本t检验和独立样本t检验。

2 结果与分析

2.1 刈割所得地上部分质量

从表1可见，红三叶地上部分质量均随刈割次数增加而减少，差异显著(P<0.05)，主要原因为红三叶具有直立生长的特性。

表1 红三叶刈割所得地上部分质量Table 1 Mass of aboveground part of red clover obtained by mowing g

2.2 刈割对异黄酮总含量的影响

从表2可知，‘海发’和‘炫丽’红三叶在每次刈割后异黄酮总含量均增加。 ‘炫丽’叶片的异黄酮总含量均高于‘海发’，但刈割处理后，‘海发’叶片的异黄酮总含量增幅为50.6%，高于‘炫丽’28.0%的增幅。刈割后6 h内茎秆异黄酮总含量均有所增加，差异不显著(P>0.05)。此外，两品种茎秆中异黄酮总含量均低于叶片。

表2 红三叶异黄酮总含量Table 2 Isoflavone contents of red clover %

2.3 刈割对叶片中异黄酮类化合物含量的影响

从表3可知，刈割前‘海发’叶片中鹰嘴豆素A和芒柄花素含量均高于‘炫丽’，刈割处理后两种化合物含量在‘海发’叶片中均降低，降幅为20.2%和15.6%，差异不显著。而在‘炫丽’叶片中均显著增加(P<0.05)，增幅为46.8%和 35.3%。刈割后两种化合物在‘海发’叶片中的含量低于在‘炫丽’中的含量。大豆苷元和染料木素含量在‘炫丽’叶片中略有下降，在‘海发’叶片中增加，但差异均不显著。

表3 叶片中异黄酮类化合物含量Table 3 Contents of three isoflavones in red clover leaves mg/g

4种化合物在叶片中含量为鹰嘴豆素A > 芒柄花素 > 大豆苷元 > 染料木素，刈割对其含量大小排序没有影响。其中鹰嘴豆素A和芒柄花素含量最多，染料木素在4种化合物中含量 最低。

2.4 刈割对茎秆中异黄酮类化合物含量的影响

由表4可知，刈割后‘炫丽’茎秆中鹰嘴豆素A和芒柄花素含量均增加，在第 2 次和第 3 次刈割后增幅均高于70%，其中鹰嘴豆素A含量在第 2 次刈割后显著增加(P<0.05),芒柄花素含量在第 1 次和第 2 次刈割后均显著增加(P< 0.05)。鹰嘴豆素A含量在‘海发’茎秆中随刈割次数增加而增加，差异不显著，芒柄花素含量在第 1 次刈割后增加，在第 2 次刈割后略有下降，差异不显著。此外，两品种茎秆中大豆苷元含量均高于叶片，‘炫丽’茎秆中的含量随刈割次数增加而增加，在第 3 次刈割时显著增加(P<0.05)。‘海发’茎秆中大豆苷元含量略高于叶片，呈先增加后降低的趋势，在第 1 次刈割后显著增加(P< 0.05)，在第 2 次刈割后降低。除 ‘海发’第 2 次刈割样品，染料木素在茎秆中的含量均高于对应的叶片处理。茎秆中该化合物含量在‘炫丽’刈割后先显著减少后增加，在‘海发’中表现为不断降低,差异不显著。

表4 红三叶茎秆中异黄酮类化合物含量Table 4 Contents of isoflavones in red clover stems mg/g

3 讨论与结论

植物与环境长期相互作用和生存竞争的过程中，形成一套完整的防御体系适应环境胁迫，降低不利环境带来的损害。一方面通过改变形态结构作为机械/物理防御策略，另一方面则利用生理生化响应作为化学防御策略[23]。

本试验比较了红三叶在6 h内2次刈割后异黄酮总含量及4种异黄酮类化合物含量的变化，结果表明，6 h内刈割损伤使红三叶植物体内异黄酮总含量大幅增加。可能原因在于刈割会使植物体产生机械损伤，导致植物体内活性氧自由基激增，而异黄酮具有抗氧化功能[16-17,24-25]，因此在植物体受到刈割后被大量合成以清除植物体内的过量自由基，最大限度降低机体的损伤，维持植物的正常生命活动。有研究表明，机械刺激会提高异黄酮合成关键酶苯丙氨酸解氨酶活性，通过提高次生代谢相关酶活性从而加强次生代谢产物的合成和积累，激活植物体内次生代谢防御系统[26]。此外，植物的应激反应模型表明，植物在正常状态下初生代谢和次生代谢处在一个动态平衡过程中，刈割作为一种较强的胁迫刺激会使该平衡产生波动或出现混沌状态，导致次生代谢的增强，即通过产生相应的次生代谢产物缓解和适应逆境胁迫环境[27-28]。

叶片由大量薄壁细胞组成，而薄壁细胞是植物积累次生代谢产物的主要部位[8]。因此，两品种红三叶均表现为叶片异黄酮总含量高于茎秆，鹰嘴豆素A和芒柄花素在叶片中的含量高于茎秆，但大豆苷元和染料木素在叶片中的含量低于茎秆。此外，‘炫丽’的异黄酮总含量高于‘海发’，但‘海发’在刈割后其增幅高于‘炫丽’，可能原因在于不同品种响应刈割刺激敏感度不同。不同的异黄酮类化合物在刈割6 h内表现出不同的变化趋势。‘炫丽’叶片中鹰嘴豆素A和芒柄花素含量在刈割处理后增加，‘炫丽’叶片中大豆苷元含量在刈割后略有下降，在‘海发’叶片和‘炫丽’茎秆中均增加，在‘海发’茎秆第 1 次刈割后增加，第 2 次刈割后下降。染料木素含量仅在‘海发’叶片刈割处理后增加，在‘炫丽’叶片及茎秆中均降低。由于大豆苷元和染料木素含量较低，因此对异黄酮总含量变化影响较小。

虽然不同品种和部位异黄酮类化合物含量变化有所差别，但是刈割后整体上不同品种和部位异黄酮总含量均增加，充分说明异黄酮是该植物受到机械损伤的主要抗逆和防御物质之一。本研究结果将为红三叶刈割后修复再生生产提供理论依据，为牧草生产科学管理与规划提供参考。