小米糠结合酚的提取工艺

李晓君 ，张梅，成悦，张建丰，丁东源，渠志灿*

1.中北大学化学工程与技术学院（太原 030051）；2.山西纳安生物科技股份有限公司（太原 030006）

我国谷子的年种植面积约140万 hm2，产量450万 t。小米糠是谷子加工产生的副产物，不仅含有丰富的营养物质，而且富含黄酮、多酚等生物活性物质，既可起到延缓衰老的作用[1-2]，又能预防一些慢性疾病，如慢性炎症、糖尿病、癌症等[3]。目前，小米糠小部分被制成家畜饲料，大部分则直接焚烧，不仅造成了环境污染，还造成了资源的严重浪费[4]，所以开发利用小米糠有着重要的意义和广阔的前景[5-6]。

小米糠中结合酚类化合物具有很强的抗氧化活性，可有效预防癌症、心血管疾病、阿茨海默病及糖尿病等[7-8]。试验以山西省7个县区的晋谷21号小米糠为原料，对其营养成分进行比较研究，并以石楼县小米糠为原料优化了小米糠结合酚的提取工艺，同时考察小米糠游离酚和结合酚抗氧化活性的强弱，为小米糠的综合开发利用提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选用山西省忻府区、昔阳县、武乡县、石楼县、沁县、广灵县、五台县7个县区的晋谷21号谷子加工产生的小米糠，过孔径0.850 mm筛后保存备用。

1.2 主要药品及试剂

浓硫酸、浓盐酸、丙酮、甲醇、正己烷、石油醚、无水乙醇、硫酸铜、硼酸、十六烷基三甲基溴化铵、氯化钠、氢氧化钠、DPPH、福林-酚、硝酸铝，均为分析纯。

1.3 主要仪器与设备

DHG-9023A电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；SOX406索式粗脂肪提取仪，济南海能仪器股份有限公司；DHS-20A水分测定仪；K9840凯式定氮仪、SH220F石墨消解仪，山东海能科学仪器有限公司；JH-14-04可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；SX2-2.5-10W马弗炉，上海一恒科学仪器有限公司；JP-040超声波清洗机，深圳市洁盟清洗设备有限公司；ME204分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；JM-B-2002电子天平，余姚市纪铭称重有限责任公司。

1.4 小米糠中营养成分的测定

1.4.1 纤维素的测定

参照GB/T 9822—2008[9]的方法。

1.4.2 蛋白质的测定

参照GB/T 5511—2008[10]的方法。

1.4.3 粗脂肪的测定

参照GB/T 5512—2008[11]的方法。

1.4.4 水分的测定

参照GB/T 5497—1985[12]的方法。

1.4.5 灰分的测定

参照GB/T 5505—2008[13]的方法。

1.4.6 多酚含量的测定

参考何志勇等[14]的方法。以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线。回归方程为A=1.313 1C-0.028 5，R2=0.996 7，通过标准曲线计算上清液中多酚的质量分数，试验重复3次。

1.4.7 多糖的测定

参照DB 22/T 2274—2015[15]的方法进行测定。

1.4.8 黄酮的测定

首先制作芦丁标准曲线，以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为A=0.033 9C-0.001，R2=0.996 7，测样品在510 nm处的吸光度，通过标准曲线计算出上清液中黄酮的质量分数，试验重复3次。

1.5 小米糠游离酚提取工艺

称取Mg脱脂小米糠，按料液比1∶10（g/mL）加入70%乙醇，在40 ℃，300 W条件下超声提取40 min。抽滤得到提取液1，准确量取滤液体积，将滤渣按料液比1∶6（g/mL）重新加入70%乙醇，超声条件不变，结束后抽滤得提取液2；合并两次提取液，记录提取液总体积V，滤渣自然风干，采用1.4.6小节方法计算游离酚的质量分数，按式（1）计算得率X。

式中：Y为提取液中游离酚的质量分数，%；V为提取液的总体积，mL；M为小米糠原料的质量，g。

1.6 小米糠结合酚的提取工艺

1.6.1 单因素试验

精确称取滤渣（由1.5小节得到的）于锥形瓶中，选取提取时间（20，30，40，50和60 min）、提取温度（20，30，40，50和60 ℃）、料液比（1∶6，1∶8，1∶10，1∶12和1∶14 g/mL）、NaOH浓度（1，2，3，4和5 mol/L）四个因素，考察各单因素在超声提取时对结合酚得率（计算方法同游离酚）的影响。提取时间40 min、提取温度40 ℃、NaOH浓度3 mol/L、料液比1∶10（g/mL）为每个单因素除自身以外的固定值。

1.6.2 正交试验优化

由单因素试验结果可知，4个因素对小米糠中结合酚得率均有一定的影响，因此选择料液比、提取温度、提取时间、NaOH浓度4个因素，以结合酚得率为指标，研究4个因素相互之间的影响关系，按L9(34)设计正交试验，见表1。

表1 正交试验设计表

1.7 游离酚与结合酚清除DPPH·自由基能力测定

用甲醇将游离酚与结合酚粗提物样品稀释至不同浓度，每个浓度的样品取0.3 mL加入试管中，加入2.7 mL 60 μmol/L的DPPH甲醇溶液，室温避光反应30 min，于518 nm测定吸光度。以含有0.3 mL甲醇和2.7 mL DPPH溶液为空白样品，以VC作为阳性对照，所有试验重复3次。按式（2）计算DPPH·自由基清除率。

式中：A0为DPPH空白对照的吸光度；As为样品与DPPH反应后的吸光度。

1.8 小米糠结合酚结构鉴定

1) 色谱条件：Innovation Ultimate C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速0.2 mL/min；柱温25 ℃；进样量5 μL；检测波长325 nm；流动相A为水-甲醇=99.5∶0.5（V/V）；流动相B为水-乙腈-甲醇=19.5∶80∶0.5（V/V）。流动相洗脱程序：50 min内B由6%升高至50%；5 min内B由50%降低至6%；6%B维持5 min，共60 min。

2) 质谱条件：离子源（ESI）喷雾电压3 500 V；负离子模式扫描；质量扫描范围m/z100～1 000；干燥气和雾化气为氮气；干燥气流9 mL/min；雾化气压力40.0 psi；离子源温度300 ℃。

2 结果与分析

2.1 不同县区小米糠中的营养成分

不同县区小米糠中各成分质量分数的不同与各地气候、温度、湿度、施肥量等有关。由表2可知，小米糠中粗纤维质量分数较高，均在49%以上，其中石楼县小米糠中粗纤维质量分数最高，为58.42%，可作为动物饲料为其提供丰富的膳食纤维。小米糠中蛋白质质量分数与王灯等[16]研究结果一致。武乡县小米糠脂肪质量分数达到9.10%，石楼县位居第二，为8.83%，可作为开发米糠油的备选原料，米糠油稳定性较弱，应加强小米糠的储藏管理，陈一等[17]研究表明低于4 ℃有利于小米糠中粗脂肪的保存。小米糠水分质量分数均在6%～8%之间，除武乡和沁县以外，其他县区小米糠水分质量分数较稳定，在6.5%左右，这可能是由于山西省南北降雨量不一致导致的。小米糠灰分质量分数整体来看相差较小，质量分数在6.60%～7.14%之间。各地小米糠游离酚质量分数大致在0.4%～0.7%之间，其中石楼县小米糠游离酚质量分数最高，达到0.72%，游离酚质量分数的高低与其抗氧化活性相关。多糖和黄酮质量分数以石楼县小米糠最高，分别为2.88%和0.59%。小米糠游离酚、多糖、黄酮这3种物质集抗氧化、免疫、预防各种慢性病等各种功效，是保健品、药品开发的首选原料。综合考虑，后续以石楼县小米糠为原料进行结合酚提取工艺的研究。

表2 不同县区小米糠的营养成分质量分数

2.2 小米糠结合酚的提取工艺

2.2.1 单因素试验

2.2.1.1 提取时间

由图1可知，随着提取时间的延长，结合酚得率先升高后降低。当提取时间为40 min时，结合酚得率显著高于其他提取时间，为1.867%，提取时间再增加，结合酚得率反而下降，可能是因为结合酚已经完全溶出，提取时间增长，结合酚得率不会再增加，还可能会由于热效应导致其氧化分解成其他物质导致得率下降，因此选择40 min为最优提取时间。

图1 提取时间对结合酚得率的影响

2.2.1.2 提取温度

由图2可知，在提取时间、NaOH浓度、料液比不变的条件下，结合酚得率在一定范围内随提取温度的升高而增加，当提取温度达到30 ℃时，结合酚得率最高，为1.893%，这可能是由于随着温度升高，溶剂与溶质间的分子运动增强，料液充分接触使结合酚溶出增加；继续升高温度，结合酚的得率反而下降，这可能是由于温度过高，溶剂部分汽化，料液接触变小，且结合酚已基本溶出，再升高温度可能会导致结合酚氧化或分解使其得率下降。因此，选择30 ℃为最适宜提取温度。

图2 提取温度对结合酚得率的影响

2.2.1.3 料液比

由图3可知，提取溶剂与材料之间的料液比显著影响结合酚得率。随着料液比的增大，提取溶剂和材料充分接触使得结合酚的得率呈现增加趋势，在料液比1∶10（g/mL）时得率最高，为1.903%；当料液比继续增大时，结合酚得率反而下降，这可能是由于结合酚已完全溶出，再增加料液比其他杂质的溶出导致结合酚得率降低。在实际生产过程中，料液比与生产效益呈正相关，溶剂用量越大，相对效益越低。因此，料液比选择1∶10（g/mL）最适宜。

图3 料液比对结合酚得率的影响

2.2.1.4 NaOH浓度

由图4可知，随着NaOH浓度的增加，结合酚得率呈现先增加后降低的趋势，当NaOH浓度为4 mol/L时，结合酚的得率达到最大，为1.918%，说明适宜的NaOH浓度可促进结合酚的溶出；当浓度继续增加时，结合酚的得率反而下降。因此，NaOH浓度选择4 mol/L最适宜。

图4 NaOH浓度对结合酚得率的影响

2.2.2 正交试验优化

由表3可知，各因素对结合酚提取率的影响主次顺序为提取温度＞NaOH浓度＞提取时间＞料液比。结合酚的最优提取条件为A3B2C1D2，即NaOH溶液4 mol/L，料液比1∶8（g/mL），提取温度30 ℃，提取时间50 min。

表3 正交试验结果

2.2.3 优化工艺条件验证试验

为了验证优化工艺的可靠性与稳定性，采用正交试验得到的最优提取条件进行3次验证试验。结果表明，3组平行试验小米糠结合酚得率平均值为1.935%，相对标准偏差δRSD为0.30%，表明通过正交试验优化的最优条件可行性较高。

2.3 小米糠游离酚与结合酚清除DPPH·自由基能力比较

如图5所示，小米糠游离酚和结合酚清除DPPH·自由基的能力均随提取物质量浓度的增加而增大，当提取物浓度为6 g/L时，小米糠游离酚和结合酚的清除能力可达80.45%和66.43%，但均低于同等浓度下VC的清除率（93.26%）。同时，同浓度下小米糠游离酚清除DPPH·自由基的能力强于小米糠结合酚。

图5 小米糠游离酚和结合酚及VC清除DPPH·自由基的比较

2.4 小米糠结合酚结构鉴定结果

通过小米糠结合酚化合物的离子流色谱图，采用HPLC-ESI-MS进行定性分析，试验质谱分析采用（-）离子模式，各小米糠结合酚化合物的相对分子质量即为质荷比值加1，由此得到小米糠结合酚中各化合物的相对分子质量。通过与相关文献进行比对，并参考国内外相关文献，可初步推断小米糠结合酚组成成分。主要峰所对应的质谱图如图6～图9所示，采用质谱分析方法，通过高分辨质谱拟合的分子式，对其质荷比和相对分子质量进行测定。

由图6和图7可知，物质A的保留时间为4.01 min，质量-电荷比为m/z121.03，高分辨质谱拟合的分子式为C7H6O2。根据数据库检索和文献报道[18]，推测该化合物为对羟基苯甲醛。

图6 小米糠结合酚的液质联用色谱图

图7 小米糠结合酚A物质的质谱图

由图6和图8可知，物质B的保留时间为5.03 min，质量-电荷比为m/z163.04，高分辨质谱拟合的分子式为C9H7O3。根据数据库检索文献报道[19]，推测该化合物为4-香豆酸。

图8 小米糠结合酚B物质的质谱图

由图6和图9可知，物质C的保留时间为7.61 min，质量-电荷比为m/z187.10，高分辨质谱拟合的分子式为C7H8O6。根据数据库检索文献报道[20]，推测该化合物为没食子酸-水合物。

图9 小米糠结合酚C物质的质谱图

3 结论

通过比较山西省7个县区晋谷21号谷子加工产生的小米糠中营养物质的质量分数，其中活性物质黄酮、游离酚均以石楼县的质量分数最高，进而以其为原料，通过单因素试验和正交试验得到小米糠结合酚的最佳提取工艺条件：料液比1∶8（g/mL）、提取温度30 ℃、NaOH浓度4 mol/L、提取时间50 min，此时结合酚得率为1.935%；提取物具有较强的抗氧化活性，6 g/L时DPPH·自由基清除能力可达66.43%；通过HPLC-ESI-MS得出，小米糠结合酚中主要含有对羟基苯甲醛、4-香豆酸和没食子酸-水合物。小米糠不仅营养丰富，且富含多酚等抗氧化活性物质，具有开发为一种新型抗氧化剂的潜力。