病死蓝孔雀胚中细菌的分离与鉴定

焦凤超 李迎晓 李洵 徐光科 赵瑜 饶丹 刘锦妮 吴海港 黄立 赵聘

摘  要：2019～2020年，河南省某蓝孔雀繁育基地连续出现死胚增多、出雏率下降等情况，通过对送检蓝孔雀死胚进行细菌病原学检测，结果共检出绿脓杆菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌和奇异变形杆菌四种细菌，分离率分别为38.82%、17.65%、17.65%和16.47%。其中绿脓杆菌和大肠杆菌混合感染分离率为16.47%、绿脓杆菌和奇异变形杆菌混合感染分离率为10.59%、奇异变形杆菌和大肠杆菌混合感染分离率为5.88%。由此可见，四种细菌单独或混合感染可能是引起该孵化场死胚增多、出雏率下降的主要原因。

关键词：蓝孔雀;绿脓杆菌;大肠杆菌;阴沟肠杆菌;奇异变形杆菌;分离;鉴定

中图分类号：S858.39    文献标识码：B    文章编号：1673-1085（2021）4-0033-05

奇异变性杆菌属于肠杆菌科变形杆菌属，是一种条件性致病菌，自1981年首次被发现以来，该菌对多种动物致病的报道不断出现[1-7]。阴沟肠杆菌属于肠杆菌科肠杆菌属，近年来关于动物发病的报道屡见不鲜[8， 9]。绿脓杆菌，又称为铜绿假单胞菌，该菌在自然界广泛分布，对鸡胚、鸭胚、鹅胚、鸽胚等表现出较强的致病性[10-13]。禽大肠杆菌是引起鸡、火鸡及其它禽类局部或全身性大肠杆菌病的病原，常表现为心包炎、肝周炎、腹膜炎、气囊炎、输卵管炎等症状，是目前严重危害养禽业的传染病之一[14]。

河南省某蓝孔雀繁育基地近两年来连续出现死胚增多、出雏率下降等情况，笔者对死亡孔雀胚蛋进行细菌分离培养、16S rDNA基因检测和系统发育分析，为揭示孔雀胚死亡原因和孔雀细菌性疾病的预防提供参考。

1  材料与方法

1.1  病料  样品来源于河南省某蓝孔雀繁育基地的死亡蓝孔雀胚蛋85枚。

1.2  主要试剂和实验动物  营养肉汤、营养琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂、细菌微量生化鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司;无菌脱纤维羊血购自南京茂捷生物科技有限公司;即用型Taq酶PCR试剂盒、DL2000 DNA Marker等购自生工生物工程（上海）股份有限公司、细菌基因组DNA快速抽提试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司;3日龄蓝孔雀购自信阳市凤天农业科技有限公司。

1.4  细菌学检查

1.4.1  细菌的分离培养  仔细检查死亡胚蛋外壳完整程度，丢弃蛋壳破损的胚蛋。将死亡胚蛋外壳消毒后，无菌采集胚体内脏组织，划线接种于鲜血琼脂培养基，37 ℃培养24 h，挑取单菌落分别接种鲜血琼脂培养基、营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基和营养肉汤，观察细菌的生长表现，并挑取单菌落革兰氏染色后镜检。

1.4.2  生化试验  将分离菌纯培养物接种细菌微量生化鉴定管，37 ℃培养24～48 h后记录结果。

1.4.3  分子生物学检测

1.4.3.1  引物设计  参考文献合成大肠杆菌phoA基因、绿脓杆菌toxR基因、奇异变形杆菌ureR基因、沙门菌invA基因和细菌通用16S rRNA引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 具体信息见表1。

1.4.3.2  16S rDNA序列测定与分析  PCR反应体系25 μL：2× Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板1 μL，超纯水9.5 μL。扩增条件：95 ℃ 预变性3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35个循环;72 ℃延伸 5 min。

PCR产物经电泳分析后，送生工生物工程 （上海） 股份有限公司测序，并通过在线Blast检索确认。

1.4.3.3  细菌特异性基因PCR检测  对经过16S rDNA检测和序列初步分析的细菌，应用合成的细菌特异性基因引物进行PCR检测。PCR产物经电泳分析后，送生工生物工程 （上海） 股份有限公司测序，并通过在线Blast检索确认。

1.5  动物致病性试验  将3日龄的蓝孔雀分为若干组，试验组腹腔注射0.1 mL（约2×109CFU）经 37 ℃ 200 r/m振摇培养16 h的主要种类分离菌的液体培养物;同时设立对照组，腹腔注射0.1 mL灭菌液体培养基。接种后每天观察并记录各组发病死亡情况。无菌采集死亡孔雀和人为处死孔雀的内脏组织进行细菌分离鉴定[19-22]。

2  结果

2.1  细菌分离与染色  從死亡的孔雀胚蛋中主要分离到4种类型的细菌。

菌1：在麦康凯琼脂培养基上形成圆形凸起、光滑湿润并且边缘整齐的红色菌落，在营养琼脂上长成隆起、湿润、光滑、灰白色菌落。革兰氏染色阴性的直杆菌，两端钝圆，散在或成对存在。

菌2：在麦康凯培养基上长出圆形、扁平、半透明、无色、湿润菌落;在SS培养基上长出橘黄色或中心成黑色的菌落。革兰氏染色镜检发现该分离菌为革兰氏阴性的中等大小、两端钝圆的杆菌。

菌3：分离菌在SS培养基上长出无色的菌落。革兰氏染色镜检发现该分离菌为革兰氏阴性的中等大小、两端钝圆的杆菌。

菌4：在营养琼脂培养基上形成润滑、隆起、边沿整齐菌落，且培养基逐渐变为绿色。革兰氏染色镜检该菌为革兰氏阴性菌中等大小，单个或成对，呈短链或杆状。

2.2  生化试验结果  四种分离菌生物特性见表2。

2.3  分子生物学检测结果  根据菌3的16S rDNA PCR检测以及基因序列在线Blast检索，确定菌3为阴沟肠杆菌（图1）;根据菌1、菌2和菌4的16S rDNA序列在线Blast检索和特异性基因PCR检测（图2～图4），确定菌1为大肠杆菌、菌2为奇异变形杆菌、菌4为绿脓杆菌。

2.4  孔雀胚蛋带菌情况统计结果  根据生化试验和分子生物学检测结果，从85枚孔雀死胚蛋中共分离到四种主要细菌：绿脓杆菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌和奇异变形杆菌，分离率分别为38.82%、17.65%、17.65%和16.47%，并且存在一定的混合感染情况，详情见表3。

2.5  动物致病性试验结果  菌1试验组的孔雀在接种之后普遍出现精神沉郁，24 h内死亡3只，剖检变化可见心包积液，肝脏、脾脏充血现象;病程较长的可见不同程度的肝周炎、心包炎和气囊炎现象。

菌2试验组的孔雀从接种10 h后出现精神沉郁、厌食，约24 h后出现腹泻和死亡，至试验的第4天，5只孔雀全部死亡，对照组孔雀无异常。

菌3试验组的孔雀从接种24 h后出现精神沉郁、厌食，腹泻等临床症状。

菌4试验组的孔雀接种18 h后出现精神沉郁、厌食、腹泻等临床症状，48 h后死亡2只;对照组孔雀均无异常。

无菌采集试验组发病孔雀肝脏和脾脏病料，抹片经革兰染色镜检细菌及细菌分离，各试验组均能发现和分离到原接种菌。

3  討论

针对某蓝孔雀繁育基地近两年来连续出现死胚增多、出雏率下降等情况，本研究对信阳市某蓝孔雀繁育基地送检的85枚病死胚蛋进行培养、生化特性及分子生物学鉴定，确定分离的细菌分别为绿脓杆菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌和奇异变形杆菌，且分离率分别为38.82%、17.65%、17.65%和16.47%。其中，绿脓杆菌和大肠杆菌混合感染分离率为16.47%，绿脓杆菌和奇异变形杆菌混合感染分离率为10.59%，奇异变形杆菌和大肠杆菌混合感染分离率为5.88%。由此可见，四种细菌单独或混合感染可能是引起孵化场死胚增多、出雏率下降的主要原因。这与课题组成员前期的部分研究结果相一致[19， 20]。

目前国内对蓝孔雀孵化期致病因素的研究资料较少，而关于家禽胚蛋细菌性病原的分离鉴定报道比较常见[11， 21-23]。郭繁霞等[11]将辽宁省某种鸡孵化场送检的245枚病死鸡胚进行病原分离鉴定，最终确定禽波氏杆菌和奇异变形杆菌的混合感染是引起该场疫情发生的主要原因。宫艳杉[22]对山东省某多个种鸭场12个批次共计315枚20日龄无破损鸭胚进行细菌分离鉴定，结果发现 245枚存在细菌感染，其中大肠杆菌、沙门氏菌和奇异变形杆菌分别占38.30%、26.24%和8.16%，是死亡鸭胚中的主要致病菌群。以上研究结果为弄清本次种孔雀孵化场发生胚胎死亡、孵化率降低、弱雏率升高等情况提供了很好的借鉴。

本次试验未开展病死孔雀胚中病毒的分离鉴定，因此，此次该孔雀孵化场疫情的发生不排除可能会有病毒的参与。李清等随机选取送检的死亡鸡胚80枚进行病毒检测，结果ALV、REV和CIAV检出率依次为6.12%、4.49%和2.86%，关于孔雀胚中相关病毒性病原的报道较少，还需要进一步的研究证实[23]。

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