侧向层析试纸条现场检测牛奶中黄曲霉毒素M1

蔡 芬,陈 伟

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

黄曲霉毒素是由常见的黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的代谢产物,其物理化学性质稳定,难以用巴氏消毒法破坏[1]。黄曲霉毒素会污染动物饲料,使饲料霉变产生黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)。当动物摄入后,黄曲霉毒素B1被羟基化成黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1, AFM1)并分泌到牛奶中[2-3]。AFM1非常需要被重视,因为它常在大多数乳制品中被发现，并且具有高度致癌性,导致人类患肝癌[4]。

此外,AFM1被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)归类为Ⅰ类致癌物[5]。这意味着牛奶和其他乳制品可能含有对人类尤其是幼儿构成威胁的AFM1,其可导致动物和人类的生长受损,乳制品质量需要人们广泛关注[6]。

根据报道,包括贝宁和肯尼亚在内的一些国家,儿童生长受损和黄曲霉毒素暴露之间存在显著关联[7]。由于这些原因,欧盟(European Union, EU)No 165/2010的最新委员会条例规定了黄曲霉毒素监管的严格参数,牛奶中AFM1的最高质量浓度[8]为0.05 mg/L。美国食品药物管理局(Food ang Drug Administration, FDA)将牛奶中的AFM1和动物饲料中的总黄曲霉毒素的作用水平[9-10]分别设为0.5 mg/L和20 mg/kg。我国在2011 年就针对AFM1 制定了相应国家标准,规定其在乳及乳制品和特殊膳食食品中的限量不得超过[11]0.5 μg/kg。

目前,常用于检测牛奶中AFM1的方法主要有薄层色谱法(thinlayer chromatography,TLC)[12]、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)[13-15]、酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)[16]。前3种检测方法存在检测时间长、前处理复杂、检测成本高、检测工作依赖于昂贵的仪器设备和专业技术人员等缺点[17],同时ELISA 法为筛选法[18],易出现假阳性现象。并且上述4种检测方法均需要进行样品的前处理,从而不利于基层的推广[19]。因此,建立针对AFM1 的高灵敏度、快速、稳定、易普及的检测方法是非常有必要的。

本实验通过胶体金标记免疫侧向层析为基本方法,进行实验条件的优化,避免了牛奶中脂肪、蛋白质等基质的影响,建立了一种简单、快速定量牛奶中AFM1的检测方法,实现了对牛奶中AFM1的快速痕量现场检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

99.9%黄曲霉毒素M1标品(化学纯)、柠檬酸三钠(分析纯)、酪蛋白(Casein)(纯度>98%)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(纯度>98%)均购于国药集团化学试剂有限公司;硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter,NC膜)、玻璃纤维膜、吸水垫、聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)底板均购于上海捷宁生物科技有限公司;氯金酸购于百灵威科技有限公司;羊抗鼠二抗、黄曲霉毒素人工抗原小鼠腹水单克隆抗体均由北京拜尔迪生物科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

Heraeus Fresco 17高速冷冻离心机(美国赛默飞科技公司),2802 UV/Vis紫外分光光度计(于山东宝莱科技股份有限公司),XYZ3000金标点样仪、CM4000金标切条机(美国Bio-Dot公司),电子天平FA1104B(上海精天电子仪器有限公司),微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司),移液器(芬兰雷勃公司),DHG-9109-25A型电热恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司),磁力加热搅拌器RCT(广州仪科实验室技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 胶体金的制备

本实验中所使用的胶体金采用柠檬酸三钠还原法[20]制备。取250 mL锥形瓶使用双蒸水冲洗干净后,向瓶内加入王水直至瓶颈在通风橱中浸泡至少24 h。王水充分浸泡后,将锥形瓶取出,用双蒸水反复冲洗蒸煮3～5遍。向洗净的250 mL锥形瓶中加入850 μL质量浓度为5 g/L的氯金酸溶液,加55 mL双蒸水放于磁力搅拌器上加热至微沸。当锥形瓶中液体微沸后,维持1 500 r/min的搅拌转速不变,迅速加入一定体积的1%柠檬酸三钠溶液。观察溶液的颜色在2 min内发生明显变化,由透明黑紫酒红,直至颜色不变后关闭热源继续搅拌10 min。冷却至室温后放在0～4 ℃条件下保存待用。

1.3.2 胶体金单克隆抗体复合物的制备

向经过0.1 mol/L K2CO3调节pH值的1 mL胶体金中加入1 mg/mL AFM1单克隆抗体,混匀反应1 h后加入质量分数为10%的牛血清白蛋白(BSA),混匀反应30 min。反应结束后,在4 ℃,9 500 r/min离心7 min,移去上清液,沉淀物用重悬液进行重悬,即制成胶体金-AFM1单克隆抗体复合物浓缩液。

1.3.3 试纸条原料的预处理及其组装

(1) 样品垫预处理。将宽度为22 mm 玻璃纤维素膜在样品垫预处理液中浸泡2 h后取，取出于37 ℃条件下烘干待用。

(2) 喷膜参数。将不同浓度的包抗原和羊抗鼠二抗用喷膜仪包被在NC膜上,形成间隔5 mm的检测线(test line,T线)和质控线(control line,C线),C线和T线喷膜速度均为0.5 μL/cm,37 ℃条件下烘干2 h,取出置于4 ℃避光干燥保存。

(3) AFM1检测试纸条的组装。将上述已处理过的样品垫、NC膜、吸水垫按试纸条结构分别粘贴在PVC底板上,用切条机切成3 mm宽的条状,置于4 ℃避光干燥贮存。免疫层析试纸条结构如图1所示。

图1 侧向层析试纸条结构

1.3.4 试纸条条件优化的评判标准

对试纸条条件进行优化时,对试纸条评判结果如下:若T线和C线处均出现红色线条，则判定结果为阴性;若T线处出现浅红色线条,同时C线出现,则判定结果为弱阳性;若T线处未出现线条,而C线处出现红色或浅红色线条，则判定结果为阳性;C线处未出现线条,无论T线是否出现线条,均判定结果为检测无效。

1.3.5 研发试纸条过程优化

(1) 偶联过程抗体添加量优化。固定调节好一定pH值的胶体金,向其中加入不同量的抗体进行偶联,设置梯度分别为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 μL,上述5组金标偶联物经重悬后进行结果判定。取4 μL重悬液加入70 μL一定质量浓度梯度的黄曲霉毒素M1样品中对试纸条上样,进行结果分析。每组实验重复3次。

该优化实验中所用AFM1样品均为用10%甲醇磷酸盐缓冲液溶液的AFM1标准样品液,样品液质量浓度梯度分别为0、0.5 μg/L。

(2) 偶联过程偶联pH值优化。 通过添加不同量的K2CO3对胶体金的pH值进行调节,设置梯度为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μL,再向其中加入一定量的抗体进行偶联,上述5组金标偶联物经重悬后进行结果判定。取4 μL重悬液混合于一定质量浓度梯度的AFM1样品中并对试纸条上样,进行结果分析。每组实验重复3次。

该优化实验中所用AFM1样品均为用10%甲醇磷酸盐缓冲液溶液的AFM1标准样品液,样品液质量浓度梯度分别为0、0.5 μg/L。

(3) AFM1试纸条检测限和标准曲线的建立。所用AFM1样品均为用10%甲醇磷酸盐缓冲溶液的AFM1标准样品液,样品液质量浓度梯度为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1 μg/L。取70 μL样品与4 μL金标偶联物重悬液混合,放入温育器温育10 min,温育后一起加入到试纸条的上样区,进行检测,每个质量浓度做3 组平行实验。10 min后拍照,使用软件进行数据处理。根据得到的数值建立剂量-反应曲线确定线性范围,建立标准工作曲线。

(4) 牛奶实际样品中试纸条检测限和标准曲线的建立。从当地超市购入新鲜牛奶经液相色谱确证阴性后,取1 mL牛奶加入不同量的AFM1标准样品使牛奶中AFM1添加量达到0.01、0.05、0.1、0.5、1 μg/L,编号为牛奶样品1、2、3、4、5、6;取新鲜牛奶样品为食品样品7,作为空白对照。加入标样处理1 h后,可用于检测;样品检测:在AFM1试纸条样品垫上滴加样品70 μL,反应10 min后,读取并判定结果。每个样品重复3 次。

(5) 牛奶实际样品中试纸条检测限和标准曲线的建立。应用AFM1免疫层析试纸条分别对稀释配制的真菌毒素标准样品溶液(黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮)以及AFM1共5种毒素混合样进行检测,AFM1质量浓度设置为0.5 ng/mL,其他真菌毒素质量浓度设置为5 ng/mL,判断试纸条的特异性。每个样品重复3次。

2 结果与分析

2.1 试纸条参数优化结果

2.1.1 抗体添加量对试纸条性能影响

抗体添加量对试纸条性能的影响见表1所列。

表1 抗体添加量对试纸条性能的影响

由表1可知,4组C线显色强度稳定,表明4组实验结果均有效;而T线显色程度随着抗体添加量的增加而增加,显色强度趋于稳定。当抗体添加量为1.6 μL时,其T线显色强度数值接近5 000,远高于0.8、1.2 μL且接近2.0、2.4 μL强度。根据免疫层析试纸条检测原理,0.8、1.2 μL的结果反映了加入抗体量较少,导致抗原未能充分和抗体结合,从而强度不高;而2.0、2.4 μL的抗体已处于过饱和状态,过量标记过的抗体随着毛细作用流向吸水垫。从经济性和有效性方面考虑,选择1.6 μL为最佳抗体添加量。

2.1.2 偶联过程偶联pH值对试纸条性能影响

偶联过程偶联pH值对试纸条性能影响如图2所示。

从图2可以看出,偶联过程中加入K2CO3的量越大,T线越浅，由此可知偶联过程中,反应液碱性越强,条带显现越弱。添加量为2.0 μL时,试纸条条带强度最大,但高浓度时不消线,原因极可能是K2CO3导致了非特异性吸附。添加量分别为4.0、5.0、6.0 μL时,T线强度极弱,原因可能是碱性过强,使抗体活性降低。综合考虑,选择3.0 μL为最优添加量。

图2 K2CO3添加量影响试纸条结果

2.2 AFM1试纸条检测限和标准曲线的建立

标品中，AFM1试纸条检测限和标准曲线如图3所示。由图3可知,AFM1 在用10%甲醇磷酸盐缓冲液溶液的AFM1标准样品液中的线性范围为0.01～1.00 μg/L,检测限为0.05 μg/L,对应的标准曲线的线性方程为:

图3 标准品中灵敏度及标准曲线

y=71.36x-569.01,R2=0.939 9。

牛奶样品中AFM1试纸条检测限和标准曲线如图4所示。

从图4可以看出,黄曲霉毒素B1 在牛奶样品中线性范围为0.01～1.00 μg/L,检测限为0.05 μg/L,对应标准曲线的线性方程为:

图4 牛奶样品中灵敏度及标准曲线

y=105.95x-1 701.09,R2=0.984 6。

2.3 AFM1试纸条特异性验证

AFM1试纸条特异性如图5所示。

图5 特异性实验结果

图5c显示除AFM1外,其他待检物质(黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN))均无法使T线消线,混合样品可以使其消线,说明试纸条对AFM1具有很高的特异性;特异性实验结果表明,其他待检物质化合物无法与AFM1单克隆抗体发生免疫反应,不能干扰检测结果,这种免疫层析检测方法具有优异的特异性。

3 结 论

目前,国内牛奶受生物毒素、农兽药影响问题较多,社会各界也对这些问题广泛关注[21]。但实际情况是现场执行情况不尽人意,出现该问题的原因之一是受现有检测手段的限制,不能现场快速检测,简单有效率地对执法人员进行指导[22]。

侧向免疫层析具有不需要专用仪器、检测速度快、操作简单方便、可长期保存实验结果、易于实现现场检测等优点,主要作为定性或半定量筛选检测手段[23-24]。目前,侧向免疫层析法已经广泛应用于各种毒素、生物大分子和抗生素的检测[25]。文献[26]成功建立了利用免疫层析试纸条对水中汞离子的快速超灵敏检测方法。

本研究利用高特异AFM1试纸条单克隆抗体,建立了黄曲霉毒素免疫层析技术,在此基础上对牛奶实际样品进行测试,确证了牛奶基质的检测结果并无影响,实现了真正的牛奶样品现场快速检测。且经过实验表明,该检测技术与HPLC检测结果一致,满足目前牛奶中黄曲霉毒素快速检测技术的要求。

在最优条件下,AFM1试纸条对AFM1的最低检测限为0.05 μg/L,检测时间为10 min。本方法作为一种快速筛查的手段,可以有效地防止AFM1中毒事件的发生,保护人们的身体健康,对于提升我国现场痕量检测和食品监测水平提供重要的技术参考。