外源赤霉素调控稻草饲用品质后水稻转录因子基因表达谱分析

董臣飞 许能祥 张文洁 顾洪如

摘要：为探索外源赤霉素（GA）调控稻草饲用品质的分子机制，采用Illumina HiSeq 2500平台的水稻表达谱芯片技术，分析研究生育后期外源赤霉素处理后水稻转录因子基因表达谱的变化。GA处理后杂交籼稻两优培九与其对照有28个基因表达发生明显变化，其中表达上调的有9个，下调的有19个;表达差异明显的基因主要属于亚油酸代谢、α-亚麻酸的代谢、戊糖和葡萄糖醛酸转换、植物病原物相互作用、淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、嘌呤代谢等途径的基因。GA处理后粳稻品种南粳44有11个基因的表达发生明显差异，其中9个基因表达上调，2个基因表达下调;差异表达基因主要集中在类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成、昼夜节律等途径上。进一步采用实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR），验证4个转录因子基因在GA处理后表达变化，与表达谱结果基本一致。

关键词：水稻;赤霉素;转录因子;基因表达谱

中图分类号：S511.01   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2021）10-0141-05

稻草饲料化利用是当前秸秆综合利用研究的热点。前人对稻草饲用的研究多集中在调制方法上[1-2]，但效果受到稻草理化性状及机械设备等因素的限制。通过栽培及遗传育种措施改善稻草饲用品质是提高稻草饲用率的简易方法，但目前这方面的研究较少。在改善稻草饲用品质的农艺措施中，施用外源赤霉素（gibberellic acid，GA）是一种有效方式。前期研究表明，水稻（Oryza sativa）生育后期进行外源GA处理能增加收获时稻草的绿叶面积，提高稻草中的非结构性碳水化合物（non-structural carbohydrates，NSC）和粗蛋白（crude protein，CP）含量，有效改善稻草饲用品质[3-4]，但缺乏深入的机理研究。

笔者前期研究表明，外施GA后籼稻品种两优培九和粳稻品种南粳44稻草的饲用品质得到显著改善，其衰老进程放缓;但是籼稻和粳稻品种间存在显著差异：两优培九GA处理组稻草中的NSC和CP含量增加幅度显著高于南粳44，与之相对应的是叶片中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量显著低于对照组，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活性显著高于对照，且其酶活性增加幅度高于南粳44，叶片中的GA含量和GA/脱落酸（ABA）的值均显著高于对照组，且高于南粳44。这说明水稻生育后期喷施外源GA能显著改善稻草饲用品质，主要通过减少MDA的积累量，提高SOD和POD活性，提高内源GA含量及GA/ABA的值来实现，且对衰老进程较快的籼稻品种两优培九的效果优于粳稻品种南粳44[5]。但GA是如何改变水稻基因表达，对生理性状产生影响的分子机理有待进一步探究。

本研究在前期外源GA对稻草饲用品质及水稻内源激素含量和衰老相关生理指标影响的基础上，采用两优培九和南粳44这2个不同类型水稻品种为试验对象，于开花后15 d喷施45 g/hm2 GA，在处理后采集水稻叶片样品，分析外源GA处理对水稻转录因子基因表达谱的影响，以期为揭示外源赤霉素调控稻草饲用品质的分子机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

利用江苏地区生产中推广应用的2个不同类型优质水稻品种（杂交籼稻两优培九、早熟晚粳南粳44）进行试验。

1.2 试验设计与田间管理

试验于2015年在江苏省农业科学院水稻试验田进行。于2015年5月10日播种，6月13日插秧。采用随机区组设计，每个处理3次重复，每小区10行，每行10株，1穴1株，行株距为30 cm×20 cm。按照常规水稻进行肥水管理。

1.3 测定内容及方法

水稻开花后挑选长势一致的主茎倒1叶挂牌，在水稻开花后15 d（9月8日）上午喷药，GA喷施浓度为45 g/hm2。喷药后14 d（9月22日，即开花后29 d）取样。采集主茎倒1叶，用锡箔纸包好放入液氮罐中冷冻保存。样品质检合格后，构建表达谱测序文库，基于Illumina技术测序平台，进行双端测序（测序平台为Illumina HiSeq2500;测序方式为PE100）。采用与表达谱测序相同的RNA进行实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）分析验证芯片的试验结果。基因表达谱分析及实时荧光定量PCR验证均委托广州锐博生物科技有限公司进行测定。

2 结果与分析

2.1 赤霉素处理后杂交籼稻显著差异表达基因转录谱

图1是两优培九CK的3个重复样本以及GA处理3个重复样本中都表达差异的基因汇总，其中红色区域表示表达上调基因，绿色区域表示表达下调基因，黑色表示表达不变。两优培九开花后 15 d 喷施GA处理后，对照组和GA处理组有28个基因表达发生显著变化，其中表达上调的有9个，下调的有19个。

如图2所示，表达差异显著的基因主要属于亚油酸代谢、α-亚麻酸的代谢、戊糖和葡萄糖醛酸转换、植物病原物相互作用、淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、嘌呤代谢等途径。

2.2 赤霉素处理后粳稻品种南粳44显著差异表达基因转录谱

由图3可知，粳稻品种南粳44 GA处理后有11个基因的表达差异显著，其中9个基因表达上调，2个基因表达下调。如图4所示，表达差异显著的基因主要属于类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成、昼夜节律-植物等途径。

2.3 实时荧光定量PCR验证

在表达差异显著的基因中选取植物激素信号转导相关基因Os03t0402800[第3号染色体（chr03）：16407695～16410007]和Os03t0181100（chr03：4248884～4249820）及淀粉和蔗糖代谢相关基因Os03t0757900（chr03：31315908～31318366）和Os02t0106100[第2号染色体（chr02）：343057～346875]进行实时荧光定量PCR验证;括号中数字表示染色体上的位置。实时荧光定量PCR验证所用材料与用于表达谱測序的材料及处理方式完全一样。对其结果进行分析，两优培九中Os03t0402800基因表达量在GA处理后明显升高，而南粳44中该基因表达量在GA处理后反而下降;两优培九和南粳44中Os03t0181100在GA处理后基因表达量均下降，但差异不明显;两优培九和南粳44中的Os03t0757900在GA处理后均明显升高;两优培九中Os02t0106100在GA处理后小幅下降，而南粳44中却明显升高，这些结果与表达谱测序结果基本一致（图5）。

两优培九对照和GA处理共同表达差异的12个基因是Os04t0650750、Os01t0186950、Os01t0186900、Os01t0556650、Os01t0850550、Os04t0650700、Os05t0312600、Os02t0808601、Os03t0757900、Os05t0161500、Os10t0509401、Os05t0380900;南粳44对照和GA处理共同差异表达的4个基因分别是Os08t0386200、Os04t0423400、Os01t0838350和Os09t0522000;兩优培九和南粳44对照和GA处理组共同差异表达基因只有1个，是位于第6号染色体（chr06）的2162738～2165150区间的Os06t0141200。

3 讨论

前期研究表明，外源GA改善稻草饲用品质的生理机制主要通过有效减少叶片中MDA的积累，提高水稻叶片的SOD和POD活性来实现[5]。在苜蓿上使用GA有类似效果[6]，脂质过氧化产物MDA含量是脂质过氧化程度的重要指标之一。它可引起生物大分子的变性或降解及生物合成的降低，破坏细胞结构[7]。研究表明，GA能有效抑制水稻旗叶MDA含量的上升，降低旗叶的脂质过氧化速度，减少MDA对细胞结构的破坏，对延缓细胞衰亡有一定作用[8]。

本研究结果表明，外源GA处理后，籼稻和粳稻品种基因表达谱的变化存在一定差异。水稻基因组中编码转录因子的基因数有1 306个。这些转录因子功能复杂，参与了包括植物的生长发育、形态建成、生物和非生物胁迫以及植物激素的代谢和传导等各个方面的调控作用。本研究中两优培九和南粳44对照转录差异的基因包含有与植物激素信号转导的相关基因Os03t0402800（chr03：16407695～16410007）和Os03t0181100（chr03：4248884～4249820）（图1至图4）。而笔者前期研究表明，外源GA处理对两优培九和南粳44的作用效果不同，GA处理对衰老进程慢的粳稻品种南粳44延缓衰老、改善稻草饲用品质的效果不如对衰老进程较快的籼稻品种两优培九影响效果显著[5]。这意味着两优培九和南粳44本身存在激素代谢差异，而笔者前期结果验证了这一推论：外源GA处理后，水稻叶片中的内源激素含量发生了显著变化，籼稻和粳稻品种间存在显著差异，两优培九对照的GA含量和GA/ABA的值在2次取样时均显著低于南粳44对照，ABA含量高于南粳44，两优培九GA处理的GA含量和GA/ABA的值在2次取样时均极显著高于对照（P<0.01），变化幅度高于南粳44[5]。本研究还发现，GA调控后淀粉和蔗糖代谢相关基因Os03t0757900（chr03：31315908～31318366）和Os02t0106100（chr02：343057～346875）发生变化（图1至图2），而前期研究表明在水稻生育后期进行外源GA处理能有效提高稻草中的非结构性碳水化合物（NSC）含量[4]，这意味着Os03t0757900和Os02t0106100基因可能参与了稻草中NSC代谢积累的过程。

本研究中GA处理后植物激素信号转导相关基因Os03t0402800（chr03：16407695～16410007）和Os03t0181100（chr03：4248884～4249820）及淀粉和蔗糖代谢相关基因Os03t0757900（chr03：31315908～31318366）和Os02t0106100（chr02：343057～346875）的转录因子表达发生显著变化，但其参与的GA处理后基因调控网络尚不清楚，而这对深入了解转录因子的功能及其在调控中扮演的角色至关重要。今后笔者将进一步用RNA干扰、蛋白互作等技术进一步研究水稻响应GA处理过程的分子机制及相互间复杂的调控网络，将转录因子基因应用于稻草饲用品质的改善中，以期综合提高稻草饲用品质。

4 结论

外源赤霉素能有效调控稻草饲用品质。两优培九经GA处理后，其对照和GA处理有28个基因表达发生显著变化，其中表达上调的有9个，下调的有19个。表达差异显著的基因主要属于亚油酸代谢、α-亚麻酸的代谢、戊糖、葡萄糖醛酸转换、植物病原物相互作用、淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、嘌呤代谢等途径。粳稻品种南粳44经GA处理后有11个基因的表达发生显著差异，其中9个基因表达上调，2个基因表达下调。差异表达基因主要集中在类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成、植物昼夜节律等途径上。

参考文献：

[1]Li J，Shen Y X，Cai Y M. Improvement of fermentation quality of rice straw silage by application of a bacterial inoculant and glucose[J]. Asian-Australian Journal of Animal Science，2010，23（7）：901-906.

[2]马艳艳，李袁飞，成艳芬，等. 不同化学处理对稻草体外发酵动态变化的影响[J]. 草业学报，2014，23（3）：350-355.

[3]Dong C F，Gu H R，Ding C L，et al. Effects of gibberellic acid application after anthesis on the feeding value of double-purpose rice （Oryza sativa L.） straw at harvest[J]. Field Crops Research，2012，131：75-80.

[4]董臣飞，顾洪如，许能祥，等. 赤霉素对不同收获时间的稻草中非结构性碳水化合物含量的影响[J]. 草业学报，2015，24（8）：53-64.

[5]董臣飞，顾洪如，丁成龙，等.水稻生育后期外源赤霉素调控稻草饲用品质的机理研究[J].草业学报，2016，25（11）：94-102.

[6]郭郁频，任永霞，刘贵河，等. 外源钙和赤霉素对干旱胁迫下苜蓿幼苗生理特性的影响[J]. 草业学报，2015，24（7）：89-96.

[7]陈信波，廖爱君，罗泽民. 大穗型水稻生育后期叶片和根系生理的特性[J]. 生命科学研究，1999，3（3）：250-255.

[8]刘 凯. 脱落酸和乙烯对水稻与小麦籽粒灌浆的调控作用及其机理[D]. 扬州：扬州大学，2008.