基于网络药理学和分子对接法探索化湿败毒方治疗COVID-19的分子机制研究＊

郭鹏飞，方坚松，许律捷，张宝月，赵 君，刘艾林＊＊，杜冠华＊＊

(1.中国医学科学院北京协和医学院药物研究所 北京 100050；2.广州中医药大学科技创新中心 广州 510405)

目前，新型冠状病毒肺炎COVID-19正在全球暴发且传播迅速、传染性强、各类人群普遍易感[1]。临床尚未出现针对COVID-19的有效且特异性药物与疫苗。

在国家卫生健康委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》试行第6、7版中，化湿败毒方是作为重型疫毒闭肺证的推荐方。化湿败毒方由麻杏石甘汤、葶苈大枣泻肺汤、宣白承气汤和藿朴夏苓汤4方组合化裁而制。研究表明，麻杏甘石汤能较显著地抑制流感病毒诱导细胞产生的细胞因子，提高机体免疫功能，从而起到治疗病毒性肺炎的作用[2]；体外实验证明宣白承气汤对急性肺损伤大鼠肺组织具有保护作用[3]；临床试验表明宣白承气汤加减能减少动脉血氧酸含量和机械通气时间而改善痰热壅肺型重症肺炎患者的症状[4]。宣白承气汤能够改善血流动力学治疗痰热腑实证重症肺炎患者[5]。2020年3月，化湿败毒方分别选择在金银潭医院、东西湖方舱医院、将军街社区卫生院开展临床疗效观察，通过对75例重症病人使用效果观察发现，化湿败毒方相比纯西医治疗在核酸转阴和症状的改善方面有显著差异。在方舱医院452例、将军路卫生院124例的随机对照治疗中显示，本方对核酸转阴和症状改善有显著的疗效[6]。但化湿败毒方对COVID-19的作用机制尚未阐明。

中药复方成分复杂，传统“1个药物、1个基因、1种疾病”的模式很难系统地阐明复方各组分及其在疾病中的作用机理。而网络药理学通过大数据挖掘、高通量筛选、网络分析等多种技术来揭示“药物(复方)-靶标(基因)-疾病”相互作用的复杂体系，成为药物研究的一种新模式[7,8]。分子对接技术通过预测受体分子和配体分子之间的结合模式和亲和力从而达到辅助药物筛选的目的，现已广泛用于特定靶标的中药及中药复方活性成分研究[9]。本研究基于网络药理学及分子对接技术探索化湿败毒方治疗COVID-19的物质基础及分子机制，并预测候选化学成分对SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2受体的亲和力，以期为后续的实验研究提供线索。

1 材料和方法

1.1 药物-归经网络的构建

从ETCM[10]数据库中检索化湿败毒方所含14味中药的归经，药物-归经网络通过可视化工具Circos Tableviewer(http://mkweb.bcgsc.ca/tableviewer/visualize/)进行绘制。

1.2 化湿败毒方中药化学成分的筛选和分析

从ETCM、TCMSP[11]和TCMID[12]、PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、BATMAN-TCM[13]数据库中获取复方化湿败毒方所含14味中药包含的化学成分，把所有的化学成分输入到TCMSP数据库进行进行口服生物利用度(OB)，药物分子的类药性(DL)和人肠细胞株渗透性(Caco-2)的筛选并使用R语言(Rx 64 3.2.5)绘制UpSet维恩图进行可视化分析。

1.3 药物-靶标网络模型的构建

根据中药名称从ETCM、TCMID、BATMAN-TCM数据库进行药物靶标的预测，其中矿物药生石膏(CSD：calcium sulfate dihydrate)的靶标从PubChem数据库获得。药物-靶点网络通过Cytoscape 3.2.1软件构建。

1.4 COVID-19靶点的收集

从PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中(COVID-19 data available)来获取COVID-19的部分靶标，并结合近期文献验证和预测的靶标来确定COVID-19的靶标集，主要预测的方法有亲和纯化质谱和基于靶标的虚拟配体筛选预测[14-20]。

1.5 蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络的构建

将筛选出来的药物靶点和COVID-19潜在的靶标导入STRING[21]网络平台，设置置信度≥0.9作为条件筛选候选靶标，最终获得药物靶标与COVID-19潜在靶标的互作关系，并利用Cytoscape 3.2.1软件构建PPI网络。

1.6 候选靶点的富集分析

将筛选得到靶点导入DAVID数据库[22]，通过限定物种为人，将所有靶基因名称校正为(Official Gene Symbol)，设定阈值P＜0.05，进行GO和KEGG信号通路富集分析；运用FunRich[23]数据库进行候选靶标的分子功能、靶标归经、临床表型等富集分析。以上分析数据都以在线绘图网站Omishare Tools(http://www.omicshare.com/tools/index.php/)和Circos Tableviewer进行可视化。

1.7 SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受体对接活性化学成分的筛选

从PDB数据库下载SARS-CoV-2 3CL水解酶Mpro和ACE2 3D结构*PDB格式。为了更好实现对接效果，选择SARS-CoV-2受体结合域(RBD和细胞的受体ACE2的分辨率为2.45A[24]。通过CB-Dock网站[25]进行分子对接，执行AutoDock Vina(1.1.2版本)。

2 结果

2.1 化湿败毒方中的中药-归经网络

根据ETCM数据库检索复方的中药的归经信息，构建复方的中药-归经网络(图1)。网络中中药连接度(Degree)最大的是肺经(Lung meridian)，方中有10味中药相对特异性的归于肺经，分别是麻黄、杏仁、甘草、藿香、厚朴、半夏、茯苓、黄芪、葶苈子、石膏。

2.2 化湿败毒方中的药物成分的分析

通过多个在线数据库的检索和收集，最后获得化湿败毒方中14味中药共1614个化学成分。麻黄(MH)、杏仁(XR)、甘草(GC)、厚朴(HP)、苍术(CZ)、草果(CG)、半夏(BX)、茯苓(FL)、黄芪(HQ)、葶苈子(TLZ)、赤芍(CS)、藿香(HX)、大黄(DH)和石膏(SG)中所含的化学成分分别有363、113、280、139、49、59、116、34、87、68、119、94、92、1个。以OB≥30%，DL≥0.18，Caco-2＞-0.4为标准筛选出化学成分240个，其中21个来自麻黄，18个来自杏仁，88个来自甘草，2个来自厚朴，9个来自苍术，8个来自草果，11个来自半夏，15个来自茯苓，16个来自黄芪，7个来自葶苈子，20个来自赤芍，9个来自藿香，16个来自大黄。生石膏的化学成分是calcium sulfate dihydrate(CSD)。化湿败毒方中筛选的14味中药中化学成分之间相互关系的基本信息(图2)。

图2 化湿败毒方14味中药的成分分布及其协同作用

2.3 化湿败毒方中的药物-靶标网络图的构建

把收集到的14味中药的1412个靶标导入DAVID数据库进行KEGG通路富集分析，最后得到159条通路，将159条通路手动导入KEGG数据库进行系统归类，最后得到14条通路144个药物靶标参与人体传染病系统。将复方中的药物和靶点分类数据构建成属性表格，导入Cytoscape 3.2.1软件中构建药物-靶点网络图(图3)。图中红色的节点代表相对特异性参与人体感染性疾病系统的靶标，绿色的节点代表药物。网络中共有334条边，158个节点。在网络图中对应中心度值的变化与此节点的边所连接的等级值(Degree)值呈正相关，Degree值越大，表明(Betweenness Centrality)中心度值越高。药物可以同时靶向多个靶标，而一个靶标又可以和多个药物作用起到治疗疾病的作用。比如，本研究药物靶标预测到麻黄、半夏、藿香和杏仁可以靶向TNF；临床研究表明，与正常人相比，COVID-19感染病人血清当中的IL-6、IL-8和IL-1A显著增加。同时，与已知的MERS-CoV感染患者(已知Th1/Th17反应)相比，COVID-19患者血清的细胞因子IL-4和TNF-α急剧升高[26]。同时，半夏、麻黄可以靶向IL2；茯苓、藿香和杏仁可以靶向IL1B；藿香可靶向IL13；草果可靶向IL10。Ruan Q对金银滩医院和同济医院确诊的SARS-COV-2感染的68例死亡病例和82例出院病例进行了回顾性研究，最后表明COVID-19死亡率可能是由于病毒激活的“细胞因子综合症”所致[27]。说明化湿败毒方中的中药活性成分可能通过作用于细胞因子而达到治疗COVID-19的目的。

图3 化湿败毒方药物-靶标网络

2.4 PPI网络的构建和候选靶标的筛选

为了说明药物靶标和COVID-19靶标的关系，运用STRING工具进行化学成分靶标和COVID-19靶标相互作用的PPI构建。选择最高的置信度(Highest_confidence)≥0.9作为筛选的标准，最后获得200个靶标。选择其中置信度(confidence)≥0.95的72个靶标作为候选靶标，打分函数(Combined_score)见附录1。其中，COVID-19靶标29个，药物的靶标有51个，其中有8个靶标是COVID-19和药物共有的靶标，包括COMT、DNMT1、IMPDH2、PRKACA、HDAC2、ITGAL、SMAD3、RIPK1(图4)。COVID-19靶标和药物靶标相互作用打分前10的靶标对分别是PHB-PHB2、RAE1-NUP98、DDX1-RTCB、PRKACA-PRKAR2B、RAENUP54、ITGAL-ICAM1、NUP62-NUP214、NUP62-NUP88、NUP62-NUP54和NUP88-NUP214。靶标相互作用打分越高，COVID-19靶标和药物靶标相互作用越强。因此，选择以上72个候选靶标作为化湿败毒方预防和治疗COVID-19的关键靶点，见附录2。

附录1 药物靶标和COVID-19靶标之间的PPI网络打分值

附录2 72个候选靶标信息

图4 药物靶标和COVID-19靶标的蛋白-蛋白(PPI)相互作用网络

2.5 候选靶标的GO和KEGG富集分析

为了更进一步探讨化湿败毒方通过调控候选靶标来预防和治疗COVID-19的具体机制，通过DAVID数据库对72个候选靶点进行GO生物学过程、细胞组成和KEGG通路富集分析(图5)。GO分析结果集中于：①生物学过程，涉及细胞过程、代谢、信号传导、细胞增值、免疫等；②细胞组分中所涉及各种细胞器、突触、突触酶、封闭膜的发光体、细胞连接等；③分子功能集中于蛋白的结合、催化、转录传导等活性；④通路富集分析集中于细胞对有机物的应答、pri-miR的正调控、凋亡信号通路、调节核质等。

图5 化湿败毒方候选靶标的富集分析

KEGG通路富集分析最后得到68条信号通路(P＜0.05)，涉及传染病的通路有15条：Hepatitis B(hsa05161：P-Value=2.09×10-10)、HTLV-I infection(hsa05166：P-Value=2.60×10-10)、Epstein-Barr virus infection(hsa05169：P-Value=3.82×10-10)、Herpes simplex infection(hsa05168：P-Value=3.85×10-7)、Chagas disease(American trypanosomiasis)(hsa05142：P-Value=2.78×10-6)、Influenza A(hsa05166：PValue= 1.68× 10-5)、Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection(hsa05120：P-Value=2.25×10-5)、Leishmaniasis(hsa05140：P-Value=3.15×10-5)、Measles(hsa05162：P-Value=1.42×10-4)等。说明富集到的候选靶标在传染病系统方面发挥着重要的作用。涉及的基因有ATP6V1A、ATP6AP1、RELA、JUN、NFKBIA、NFKB1、IKBKB等。将富集到的68条通路输入到KEGG数据库进行通路的系统分类，最后发现，候选靶标富集的通路归属于免疫系统、内分泌系统、神经系统等。富集的结果见附录3。

附录3 候选靶点KEGG富集分析

2.6 候选靶标归经和临床表型的分析

中医的辨证用药讲究归经，归经指药物作用及药效在人体的脏腑经络的定位。通过药物-归经网络得到化湿败毒方中有10味中药相对特异性的归属于肺经。为了证明药物靶向靶标的归属，运用FunRich数据库进行富集分析来说明候选靶标在人体组织中表达的部位。富集结果表明，候选的72个靶标中，在肺部相对特异性表达的靶标有BRD2、DNMT1、ERC1、HDAC2、PTGES2、SMAD3、MARK2、COMT、RIPK1、ATP6AP1、ACE2等，共有62个，占候选靶标的88.9%。主要表达在肺、肺癌、支气管、支气管肺泡等部位。说明化湿败毒方的候选靶标在肺部表达非常高。同时，候选靶标还在H293 cells、K-562 cells、肾、子宫内膜、胎盘、膀胱、睾丸以及肠道等组织部位表达。为了更近一步说明候选靶标参与的机制，同时对靶标的临床表型进行富集分析(图6)。富集结果说明，化湿败毒方作用的候选靶标可能参与的临床表型有：多种癌症、支气管息肉、尿失禁、肠出血、舒张压和收缩压升高以及脑干病变等。

图6 化湿败毒方候选靶标的组织表达和临床表型的富集分析

2.7 SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受体对接活性化学成分的结果

研究证明，SARS-CoV-2、SARS-CoV以及MERSCoV三者同为β属冠状病毒，瑞德西韦及氯喹可在低浓度下能有效控制Vero E6细胞的SARS-CoV-2感染，而利托那韦、洛匹那韦及利巴韦林为抗SARS-CoV的有效药物[28-31]。因此本研究选择上述筛选的化学成分中类药性≥0.8的活性成分以及阳性对照的5种化学药与SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受体分别进行分子对接(表1、图7)。对接结果提示，与SARS-CoV-2 3CL水解酶亲和力最高的前10位依次是kanzonol F(Vinascore=-9)、xambioona(Vinascore=-8.4)、洛匹那韦(lopinavir;Vina score=-8.2)、瑞德西韦(remdesivir;Vina score=-8.2)、dehydropachymic acid(Vina score=-7.8)、eburicoic acid(Vina score=-7.7)、isoglycyrol(Vina score=-7.6)、polyporenic acid C(Vina score=-7.6)、dehydroeburicoic acid(Vina score=-7.6)、cavidine(Vina score=-7.5)。预测的12个化学成分中有11个活性成分与SARS-CoV-2 3CL水解酶结合能小于-7 kJ·mol-1。而且化湿败毒方中筛选的所有活性化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶结合能均小于-5 kJ·mol-1。与ACE2亲和力的打分最高的是dehydroeburicoic acid(Vina score=-8.5)，分数小于亲和值的阈值-7.0，且都低于5个化学药物的分数。由此可见化湿败毒方中的化学成分可能与受体蛋白SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2形成构象能量低，结构稳定，结合活性较高，同时也说明化湿败毒方可能通过与ACE2作用，进而调控多个候选蛋白或者通路预防COVID-19的进一步发展。

图7 dehydropachymic acid、kanzonol F、xambioona与SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2的分子对接模式

3 讨论

中医对疫病有非常系统和全面的认识。新冠肺炎属中医“疫”范畴，主要为“湿毒”疫气，病位主要在肺，随着病情的发展而出现其它脏器的损伤[51]。清代吴鞠通于《温病条辨》中论述到：“温病由口鼻而入，鼻气通于肺，口气通于胃，肺病逆传，则为心包；上焦病不治，则传中焦，胃与脾也；中焦病不治，即传下焦，肝与肾也。始上焦，终下焦”。疫病以温、燥、湿为主的疫病在三焦中的传变，并可殃及肝肾等重要脏腑[32]。目前研究也表明，新冠病毒除了造成患者最常见的肺脏损伤，还出现心脏损害、肾功能衰竭、神经系统症状、腹泻、结膜炎、凝血功能异常等并发症状[33]。

网络药理学分析结果可知，候选靶标参与特定种类的癌症的多条信号通路、多种炎症因子的表达、神经系统的调控、机体免疫反应等。近期的研究表明，患者感染病毒后会出现癌症的易感性[34]、具有神经系统症状、免疫力的底下等症状。DAVID富集分析表明，候选靶标参与多条癌症的通路，包括hsa05200、hsa05202、hsa05203等，参与的基因有SIN3A、CEBPB、HDAC2、SP1、HDAC1、RELA、TP53、NFKB1、NCOR1等；多条免疫的通路包括hsa04620、hsa04621、hsa04660、hsa04662等，参与的基因有ATP6V1A、ICAM1、ITGAL、FOS、ATP6AP1、JUN、TGFB1等；神经的通路包括hsa04722、hsa05016，参与的基因有RELA、JUN、MAPK3、TP53、NFKBIA、NFKB1、IKBKB等；造成皮肤感染的通路包括hsa05168、hsa05162，参与的基因有CSNK2A2、FOS、CSNK2A1、RELA、JUN、CREBBP和TP53等(表1)。其中B cell receptor signaling pathway(hsa04662)和T cell receptor signaling pathway(hsa04660)已有文献报道。研究发现新型冠状病毒的机体有效免疫反应的潜在靶点靶向B细胞和T细胞表位区域可能有利于机体产生特殊的免疫力[35]。Bohmwald K[36]等研究人员认为冠状病毒(Cov)对神经存在侵袭，从而导致诸如多发性硬化症和脑脊髓炎等临床反应。同时，研究表明，COVID-19患者可以感染皮肤引起皮损，皮损内存在病毒、有传染性，主要包括皮肤瘀点、融合性紫癜和麻疹样皮损等症状[37]。本研究通过KEGG富集分析发现，候选靶标参与的两条通路是有关皮肤感染，包括单纯疱疹感染和麻疹。

分子对接技术结果表明，与化学药相比，中药活性成分的对接分数更优，潜力更大。对接的12个中药活性成分中，kanzonol F和xambioona小于Vina最低得分的化学药物洛匹那韦；而dehydropachymic acid、eburicoic acid、isoglycyrol、polyporenic acid C等成分和洛匹那韦、瑞德西韦的得分相近。而与ACE2对接的12个中药活性成分中，化学成分的对接效果均优化学药物，这说明化湿败毒方的活性成分在治疗COVID-19中发挥了重要作用。

综上所述，本研究通过网络药理学方法和分子对接技术对化湿败毒方防治COVID-19的物质基础和分子机制进行预测和探讨，揭示化湿败毒方治疗COVID-19“多成分、多靶点、多通路”的特点，经过查阅相关文献，验证了预测结果与其他实验和临床研究的结果有较高的一致性。但运用网络药理学方法进行研究也存在一定的局限性。虽然本文中数据库ETCM、TCMSP、TCMID、PubChem和BATMAN-TCM均为国内外知名专业数据库，对于数据库都有定期维护和更新，可以保证化学成分和作用靶点有较好的准确性和查全性。但由于中药化学成分有些含量较低，难以分离提纯和结构鉴定，这对于全面阐释中药化学成分的作用具有局限性。此外，有些化学成分的活性报道较少，因此其靶点和归经研究也具有一定的局限性。本研究中药成分选择的筛选标准是OB≥30%，DL≥0.18，Caco-2＞-0.4，这三个指标对药物成分在人体吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)及排泄(excretion)过程中扮演者非常重要的作用[11,38]。同时，预测到新的化学成分和靶标仍需后续的药理学实验和临床的研究和验证。

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