半夏泻心汤对运动应激性胃溃疡大鼠相关因子的影响＊

罗敏怡，潘华山，郑嘉怡，耿 雪，贺生才，荆纯祥＊＊

(1.广州中医药大学体育健康学院 广州 510006；2.广东食品药品职业学院 广州 510520；3.广州中医药大学科技创新中心 广州 510405)

运动应激性胃溃疡是因剧烈运动引起的急性胃黏膜损伤，可表现为糜烂性胃炎，从无症状的浅表溃疡病变、隐匿性胃肠出血到明显的临床消化道出血[1]，好发部位是胃体和胃底，其次见于胃窦及十二指肠，多发生于力竭性耐力运动项目的运动员，如马拉松和游泳运动员。虽然轻微的运动应激性胃黏膜损伤有自愈性，往往还未发现机体已恢复，但是急性的胃粘膜损伤会引起胃脘部疼痛，严重时可进展为消化道出血，危及生命，研究证实，应激性溃疡有1.5%到15%的可能性会继发消化道出血，这取决于患者是否接受了应激性溃疡预防[2]。运动员为提高成绩必须加大运动量，但是运动强度太大易引起应激性损伤，预防运动应激性胃溃疡的发生对提高运动员身体素质、训练质量、竞赛效率具有重要意义。应激性胃溃疡的发病机制尚无确切的结论，广泛认为这与中枢神经-内分泌-免疫系统、氧化应激等相关，是在应激状态下，胃黏膜的保护因子无法跟损伤因子抗衡，而引发机体做出的非特异性防御反应。随着研究的深入，人们开始认识到炎症因子在应激性溃疡的发生机制中也扮演了重要角色，但是相关研究尚少，具体的作用仍需要实验论证。

目前临床上防治应激性溃疡的措施主要有化学药物抑制胃酸分泌(如奥美拉唑、雷尼替丁等)、抗酸药物中和胃酸(如碳酸氢钠、氢氧化铝等)、细胞保护药物抑制细胞凋亡等[3]，但仅能短时间改善症状，并且若长期服用存在腺体萎缩、肝功能受损、头晕、乏力甚至是关节疼痛、心率失常、造血功能障碍、乳房发育异常、阳痿和全身性碱中毒等不良反应[4,5]。如今，药物安全越来越受重视，使用天然产物来开发副作用最小的药物成为新趋势。

中医药防治应激性溃疡的疗效确切[6]，能有效地减少药物的毒副作用。中医认为，应激性胃溃疡主要病因是内因外因两种，内因多为情志所伤，外因为外邪侵袭，如风寒、湿毒等困阻脾胃，郁而成瘀，导致气血亏虚、肝郁气滞，从而引起的胃脘痛、吞酸、嘈杂等脾胃疾病，治疗上以理气和胃或补气活血为主[7]。半夏泻心汤出自《伤寒论》，有和胃降逆、散结开痞之效，是治疗痞证的代表方。在现代研究的基础上，半夏泻心汤适用范围日渐扩大，多用于各种消化道疾病，如消化性溃疡、结肠炎、幽门螺杆菌感染相关性胃炎等均取得很好疗效[8]，并且可以减少机体的白介素-1(Interleukin-2，IL-2)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-8(Interleukin-8，IL-8)等炎症因子的分泌，减轻消化道溃疡症状，对防治应激性胃溃疡有一定的启示意义。本实验目的在于探究半夏泻心汤通过抑制炎症反应预防运动应激性胃溃疡的机制，为中医药防治运动应激性胃溃疡提供依据，探索防治运动应激性胃溃疡的新方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

无特定病原体(Specific pathogen Free，SPF)级SD大鼠，雄性，体重200±20 g，购于广东省医学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(粵)2018-0002。饲养环境：广州中医药大学实验动物中心SPF动物实验室，本实验过程中对大鼠的处理已通过广州中医药大学动物伦理委员会同意。

1.1.2 仪器

JJ3000动物电子秤，G＆G公司产品；BS224S电子天平(1/万)；圆柱形游泳水池(直径64 cm，高73 cm)，常州恒尊塑料制品厂家；RESEE体育秒表，深圳市锐赛科技有限公司。德国SARTORIUS产品；HH-6数显恒温水浴锅，金坛市富华仪器有限公司产品；SCIENTZ-48型电动组织匀浆器，宁波新芝宁波新芝公司；3K30离心机，SIGMA公司产品；-80℃超低温冰箱，美国Thermo公司产品；Bio-RAD 680酶标仪，美国伯乐公司产品。CM1950自动真空组织脱水机、EG1160包埋机、RM2135石蜡切片机、HI 1210摊片机、HI 1220烘片机，Leica公司。

1.1.3 试剂

从版本角度来说，改革开放40年，我国图书出版的创新发展成为主流。1978年图书出版的版本，以再版图书为主，一版一次的图书有562种，占年度图书出版的4.1%。2017年图书出版的版本，以新版图书为主，一版一次的图书有295275种，占年度图书出版的88.68%。为加强图书出版的系统化管理，1991年，我国学习借鉴国际图书出版管理的先进经验，引进了CIP图书在版编目，使图书出版版本管理的规范化、目录著录的标准化、服务公众的信息化程度得到了进一步提升。

中药饮片(法半夏、黄芩、黄连、干姜、甘草、人参)购自广东省中医院中药房；奥美拉唑胶囊(批号：国药准字H20103295，生产批号：181102)，湖南方盛制药有限公司。TNF-α试剂盒(批号：20180524)、IL-1β试剂盒(批号：20180524)、IL-6试剂盒(批号：20180524)均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 造模方法

取40只健康SPF级雄性成年大鼠，体重200g±20 g，适应性喂养1周后，记录体重变化，并进行1次适应性游泳训练，将体重差异较大的及不会游泳的大鼠淘汰，留取32只大鼠，通过随机数表法将其分为空白组(n=8)、模型组(n=8)、中药组(n=8)、西药组(n=8)，在完成最后1次灌胃后，通过一次性负重游泳力竭进行应激性胃溃疡造模。造模前禁食24 h，每只大鼠尾部系2%体重的金属丝，以组为单位，依次将各组大鼠放入圆柱形游泳水池(直径64 cm，高73 cm，水深50 cm)中游泳，力竭标准为“大鼠沉入水中，经过10 s后仍不能返回水面”[9]。同时观察大鼠，当其运动极不协调、屡次下沉时，将其从水中捞出。造模完成后所有组别的大鼠取材。

1.2.2 干预方法

除空白组外均予药物干预：中药组予半夏泻心汤0.01 mL·g-1灌胃，西药组予0.01 mL·g-1奥美拉唑溶液灌胃，模型组予等量的蒸馏水灌胃，1天/次，连续7天。

1.2.3 取材

力竭游泳后，各组大鼠用10%水合氯醛(0.003 mL·g-1)腹腔注射麻醉，于剑突下腹正中线切开腹腔并游离胃，将胃取出，置于4%多聚甲醛固定l0min，沿胃大弯剪开胃腔并使胃黏膜展开，生理盐水漂洗3遍后拍摄胃黏膜图片，观察其大体及计算溃疡指数(Ulcer index，UI)。标本留取分为2个部分：第1部分，在胃黏膜溃疡或出血明显处取0.5 cm×0.5 cm组织块，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋，进行苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining，HE)染色后，于镜下观察胃黏膜组织结构；剩余的胃黏膜用冰冷生理盐水反复冲洗3次后，用载玻片将胃黏膜刮下，放入冷凝管，并迅速放入液氮保存，留作酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)检测胃黏膜细胞中肿瘤坏死因子-α(Tumour necrosis factor，TNF-α)、白介素-1β(Interleukin1，IL-1β)、白介素-6(Interleukin6，IL-6)的表达水平[10]。

1.3 检测指标

1.3.1 胃黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6的测定

1.3.2 计算UI

将全胃取下，沿胃大弯侧将胃剪开，用生理盐水冲洗胃黏膜，然后将胃展开平铺在白纸上，相机拍摄胃黏膜图像后于计算机下观察溃疡。按Guth标准[11]计算UI(点状出血为1分；线状出血，长度＜1 cm为2分，1-2=cm为3分，2-4 cm为4分，＞4 cm为5分，宽度＞1 cm时分值×2)

1.3.3 病理切片

在胃黏膜出血或糜烂明显处取0.5 cm×0.5 cm组织块，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，固定后用纯水冲洗、修剪整齐后置于包埋盒中，放入自动脱水机进行脱水透明，脱水的步骤是：80%、90%、95%、100%各种浓度乙醇2 h和二甲苯(2道透明)，石蜡包埋、切片，按脱蜡、复水、染色、脱水、透明、封片固定的顺序完成HE染色后，通过显微镜观察胃黏膜组织的结构变化。

1.4 统计方法

运用SPSS20.0软件进行统计分析，计量资料用平均数±标准差表示，多组间比较采用one-way ANOVA，两组间比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计意义，应用GraphPad 5.0软件作图。

2 结果

2.1 胃黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6的表达

空白组大鼠胃黏膜的IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量均明显低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)。中药组和西药组的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量也明显低于模型组的表达量，差异有统计学意义(P＜0.01)；中药组的IL-1β、IL-6、TNF-α表达量与西药组的相比无明显差异(P＞0.05)(表1、图1)。半夏泻心汤和奥美拉唑均能有效抑制炎症因子的表达，减轻炎症反应，保护胃黏膜。

图1 胃黏膜IL-6、IL-1β、TNF-α的表达量

表1 胃黏膜IL-6、IL-1β、TNF-α的表达量

2.2 UI的差异

空白组大鼠胃黏膜的UI显著低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)；中药组和西药组的UI均明显低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)，中药组和西药组对比UI无明显差异(P＞0.05)(表2)。

2.3 胃黏膜解剖形态图

肉眼可见，模型组大鼠的胃黏膜明显充血红肿，大量线状、片状出血点；西药组和中药组胃黏膜均有少许充血，有点状出血；空白组胃黏膜红润光滑，无糜烂、无出血。

组别空白组模型组中药组西药组例数8 8 8 8溃疡指数0images/BZ_374_1006_512_1026_531.png8.25±2.06 1.625±0.47*▲1.5±0.0.5*

图2 胃粘膜解剖图

2.4 病理切片

胃黏膜分为3层，分别是黏膜上皮层、固有层和黏膜肌层，急性应激性胃溃疡一般较浅，多损及黏膜上皮层和固有层，边界清晰，偶尔破坏肌层，甚则穿孔。正常胃黏膜上皮为单层柱状上皮，由表面黏液细胞组成，在HE染色下着色较浅以致透明。固有层约占2/3(与胃黏膜量度之比)主要由红染的壁细胞和偏蓝染的主细胞，这两种细胞体积大、细胞质丰富、核质比小。壁细胞合成和分泌胃酸，主细胞分泌胃蛋白酶原，两者对维持胃黏膜的稳态起着重要作用[12]。空白组黏膜结构完整无缺损，腺体排列整齐，未见明显细胞或组织增生(图3)。模型组大鼠胃粘膜上皮层脱落，边界清晰；黏膜上皮层少许糜烂或斑驳脱落，腺体排列杂乱；上皮层和固有层大量红细胞聚集，呈片状出血灶，组织间隙充血水肿(图4)。中药组胃黏膜排列规则，黏膜少许增厚，组织间质有条状出血灶(图5)。西药组胃黏膜上皮结构基本完整，腺体排列尚整齐，伴有组织的轻微水肿，组织间隙弥漫分布少量红细胞，少许空泡样变(图6)。

图3 空白组胃黏膜

图4 模型组胃黏膜

图5 中药组胃黏膜

图6 西药组胃黏膜

3 讨论

TNF-α、IL-1β，IL-6是炎症反应的关键因子，它们能激活巨噬细胞，诱导血管内皮细胞表达黏附分子，并且促使炎性细胞游走和增强其功能，故又称为促炎性细胞因子，是急性期反应和炎症反应必不可少的催化因素，故可以用于判断运动应激性胃溃疡的炎症程度。

在无菌外科手术中，血清IL-6水平升高先于体温升高和血清急性期蛋白浓度升高，所以IL-6常作为炎症发生的敏感性指标。在机体处于应激状态时，IL-6发出预警信号提示紧急事件的发生，启动各项应激机制，刺激核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)等一系列信号通路，增强炎性细胞因子如IL-6、TNF-α、IL-1β等mRNA的转录，同时，TNF-α和IL-1β也激活转录因子产生IL-6[13]。过量的TNF-α可提高粘膜微小血管管壁通透性，破坏血管内皮细胞，释放炎症介质，刺激IL-1β的产生，导致中性粒细胞核聚集，提高其吞噬功能，最终产生粘膜血供障碍并加重粘膜炎症反应[14]。IL-1β蛋白是一种可诱导的蛋白，在微生物入侵或组织损伤时合成，是局部炎症和保护反应发生的必要条件。研究表明，消化性溃疡患者和幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori，Hp)阳性患者[15]、灌胃给予乙醇[16]和应激诱导后，血清中IL-1β的生成增加；细胞因子也直接增加垂体前叶[17]细胞分泌促肾上腺皮质激素和脑内啡肽。这证实了细胞因子作为体液因子的作用，增强了应激后反应的严重程度。

与此同时，神经内分泌稳态环路与细胞因子表达呈相关性，这些促炎症细胞因子会强烈刺激下丘脑-垂体-肾上腺轴(The hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)释放糖皮质激素(Glucocorticoid，GC)。而GC能够诱导抗炎因子的合成以及抑制炎症因子的合成，并稳定溶酶体膜，保护胃粘膜细胞免受炎症因子的损害，从而形成一个神经内分泌的完好循环[18]。运动应激性胃溃疡大鼠胃粘膜中IL-6、IL-1β和TNF-α等细胞因子显著增加时，打破了这个稳态循环，间接地诱发了溃疡的形成。

现代研究证实，半夏泻心汤具有消炎、抑菌和双向调节胃肠运动的功能，促进相关激素、蛋白分泌，有助于胃肠组织的局部生长，可以提高机体免疫力，故而此方在临床的使用范围越来越广，尤其是消化系统疾病。多项实验研究证实半夏泻心汤有保护胃黏膜的作用，徐颖等[19]提出半夏泻心汤可调控血液、胃和脑组织的血管活性肽的产生和释放，维持胃黏膜的完整性。张忠等[20]表明半夏泻心汤全方和各拆方组，可通过控制脑及胃内自主神经分泌，保护胃黏膜，减少溃疡；姜惟等[21]的动物实验提示半夏泻心汤可提高超氧化歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活力，阻止或降低组织的脂质过氧化酶反应，从而降低自由基对胃黏膜的刺激，保护胃黏膜。周文等人[22]认为半夏泻心汤通过下调Hp感染小鼠机体血清TNF-α含量，减轻了胃黏膜的炎症反应从而保护胃黏膜。实验证明，半夏泻心汤有明显的抗炎作用，抑制细胞因子的表达，它可能通过调节巨噬细胞内丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)炎症信号通路中细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK)、P38的磷酸化水平，抑制巨噬细胞分泌炎症因子IL-1β、IL-8和TNF-α[23]。

本实验也通过半夏泻心汤干预观察其对运动应激性胃溃疡大鼠的胃黏膜保护作用，大鼠在力竭运动的应激状态下，炎症反应被激活，炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α大量表达，在本次实验中，模型组的TNFα、IL-1β、IL-6与空白组的相比表达量明显增加，而半夏泻心汤组和西药组大鼠的表达明显降低；说明半夏泻心汤能有效地抑制大鼠胃黏膜的炎症因子的表达。同时，半夏泻心汤组和西药组的溃疡指数明显比模型的的溃疡指数减少，病理切片跟模型组相比，通过造模前给予半夏泻心汤或奥美拉唑灌胃，胃粘膜病理学形态改善明显，说明半夏泻心汤可抑制炎症反应的发生，从而保护胃黏膜，减少应激性溃疡的发生。但是，因为半夏泻心汤的药物组成较为复杂，有效成分有百余种，包括槲皮素、黄芩苷、甘草苷等都已在临床和实验中验证有抗炎作用，具体的发挥消炎抑菌、保护胃黏膜的的成分未明[24]，是复合药物共同产生的疗效还是其中某一药物单体的作用尚需商榷，这将会是以后的研究方向，为防治运动应激性溃疡寻找更精准有效的中医药疗法。

4 结论

半夏泻心汤可提高机体免疫力，降低胃黏膜中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达，抑制炎症反应，减少运动应激性胃溃疡的发生。也启示我们以后研究方向可以进行中药复方与药物单体的疗效对比，寻找更精准有效、无毒的中医药疗法预防运动应激性胃溃疡。