固相萃取-液质联用法测定藤茶中11种真菌毒素*

万青，肖凌，聂晶，胡敏，王文清，方建国

(1.华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，武汉 430030；2.湖北省药品监督检验研究院，国家药品监督管理局中药质量控制重点实验室，湖北省药品质量检测与控制工程技术研究中心，武汉 430075)

真菌毒素(mycotoxin)是产毒真菌在适宜环境条件下产生的有毒代谢产物，具有致癌、致畸、致突变和肝肾、生殖系统损害等毒性作用[1-3]。近年来，中药材真菌毒素安全性问题引起了国内外高度重视。中药材基质复杂，种植、生产、流通的全过程周期较长，控制不当易受多种真菌毒素污染[4-6]。目前，国内中药材受黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)污染较普遍，其他中药材中常见真菌毒素还有赭曲霉毒素(ochratoxin A，OTA)、伏马毒素(fumonisin)和玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)类毒素等[4]，2015年版《中华人民共和国药典》仅收录了远志、大枣、肉豆蔻等19种中药材黄曲霉毒素限度检查[7]。为更好控制中药材质量，进一步提高中药安全性，建立灵敏、快速、准确的多种真菌毒素同时检测方法十分必要。

经典真菌毒素检测方法有薄层色谱法[8-9]、免疫化学法[10-12]和高效液相色谱法[13-16]等。薄层色谱法操作复杂，灵敏度和准确度欠佳，仅作为初筛使用。免疫化学法灵敏度和专属性大大增强，具有耗时短、携带方便等优势，多作为现场即时检测使用，但因其存在非特异性结合问题，不适合多种真菌毒素同时检测，大规模应用受到限制。液相色谱法作为《中华人民共和国药典》2015年版推荐方法之一，是真菌毒素定量分析的常用方法，通常搭载荧光检测器以获得更高灵敏度。但因其衍生化方式不同、完全依赖色谱分离，无法实现多种真菌毒素同时检测，且基质干扰可能导致假阳性结果。液相色谱-串联质谱法克服了上述缺点，该方法结合了色谱分离和离子选择的强大能力，可实现多成分同步检测，在保持高灵敏度性能的同时具有良好的耐用性和稳定性，是目前主流的真菌毒素检测法[17-20]。

藤茶由葡萄科植物显齿蛇葡萄Ampellosisgrossedentata(Hand.-Mazz.) W.T.Wang的嫩茎叶加工而成，具有清热解毒、利湿消肿功效。在我国广西、福建、贵州、湖南和湖北等地区广泛用于风热感冒、咽喉肿痛、湿热黄疸、目赤肿痛、痈肿疮疖、便赤等[21-26]。藤茶的传统加工过程主要包括杀青、揉捻、渥堆、干燥等工艺[27]，渥堆过程操作不当极易受到真菌毒素污染，但笔者尚未见到有关藤茶真菌毒素检测的报道。为全面评估藤茶安全性，笔者通过亲水-亲脂平衡(hydrophilic-lipophilic balence，HLB)固相萃取柱净化，联合液相色谱-串联质谱检测，建立了藤茶中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、伏马毒素B1(funioccisin B1，FB1)、FB2、OTA、ZEN、呕吐毒素(deoxynivalenol，DON)和T-2毒素(T-2)等11种真菌毒素的检测方法，以期为同时测定藤茶中多种真菌毒素提供参考，也为探索其他中药基质中真菌毒素的检测提供借鉴。

1 仪器与试药

1.1仪器 LC 30A-4500 Q-trap型液质联用仪(日本岛津公司)；ST16R型高速冷冻离心机(德国赛默飞世尔公司)；P-12型平行蒸发仪(瑞士步琦公司)；AH-30型全自动均质器(美国睿科公司)；XP-204型电子分析天平(感量：0.1 mg，梅特勒-托利多公司)，Milli-Q 纯水仪(美国密理博公司)。

1.2试剂 黄曲霉毒素混合对照品溶液(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2浓度分别为0.93，0.30，0.93，0.35 μg·mL-1，批号：610001-201804)购自中国食品药品检定研究院；FB1(50 μg·mL-1，批号：1H01J23)，FB2(50 μg·mL-1，批号：1H01J23)，AFM1(10 μg·mL-1，批号：1I00A11)，T-2毒素(100 μg·mL-1，批号：1H00I14)，DON(100 μg·mL-1，批号：1H01B10)，ZEN(25 μg·mL-1，批号：1K00H29)，OTA(10 μg·mL-1，批号：1H01B14)均购自青岛普瑞邦生物工程有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，醋酸铵为质谱纯，水为超纯水。

1.3样品 49批藤茶样品信息见表1，样品由华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部方建国教授鉴定，均为显齿蛇葡萄Ampellosisgrossedentata(Hand.-Mazz.) W.T.Wang的炮制品。

表1 藤茶样品信息Tab.1 Information of Ampellosis grossedentata (Hand.-Mazz.) W.T.Wang samples

2 方法与结果

2.1色谱条件 美国菲罗门Kinetex XB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；以5 mmol·L-1醋酸铵(pH值3.0)(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱[0～5 min，10%B；>5～6 min，10%B→20%B；>6～30 min，20%B→45%B；>30～35 min，45%B→10%B]；流速为0.2 mL·min-1，柱温30 ℃。进样量4 μL[28-29]。

2.2质谱条件 采用电喷雾离子源(electrospray ionization source，ESI)，多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)，正、负两种模式进行扫描[28-29]，各化合物质谱参数见表2，对照品及样品总离子流图见图1。

表2 11种真菌毒素质谱参数Tab.2 Mass spectrometry parameters of 11 mycotoxins

2.3混合对照品溶液的配制 分别精密吸取上述对照品适量，加甲醇配制成AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、FB1、FB2、T-2毒素、ZEN、OTA以及DON浓度依次为46.5，30，46.5，35，100，50，50，600，75，100，2 000 ng·mL-1的混合对照品溶液。

2.4供试品溶液的制备 取藤茶粉末[过三号筛，筛孔内径(355±13)μm，50目]约5 g，精密称定，置均质瓶，精密加入80%乙腈溶液100 mL，均质器上提取45 s，8 000 r·min-1离心20 min(r=10 cm)，精密量取上清液20 mL，置50 mL量瓶，加水稀释至刻度，摇匀。精密吸取稀释后的溶液20 mL，减压浓缩至约5 mL，放冷，离心，孔径0.22 μm滤膜滤过，缓慢通过已经活化好的固相萃取柱(依次用甲醇和水各5 mL淋洗活化)，直至空气进入柱子，先用纯化水5 mL淋洗，再用甲醇5 mL洗脱，收集洗脱液，于平行蒸发仪上浓缩至近干，用50%甲醇转移并定容至2 mL，放冷，离心，孔径0.22 μm滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.5线性关系与灵敏度考察 为考察基质效应对方法灵敏度的影响，将上述混合对照品溶液分别用空白基质和50%甲醇稀释成系列混合标准工作液，以峰面积对各个真菌毒素的质量浓度作线性回归，绘制标准曲线。采用公式(1)对基质效应进评估[2，30]。

A.混合对照品溶液正离子模式总离子流图；B.混合对照品溶液负离子模式总离子流图；C.供试品溶液正离子模式总离子流图；D.供试品溶液负离子模式总离子流图；1.AFM1；2.AFG2；3.AFG1；4.AFB2；5.AFB1；6.FB1；7.FB2；8.T-2；9.DON；10.OTA；11.ZEN。图1 混合对照品及供试品溶液总离子流图A.Total ion current chromatogram of mixed reference solution in positive ion mode；B.Total ion current chromatogram of mixed reference solution in negative ion mode；C.Total ion current chromatogram of test solution in positive ion mode；D.Total ion current chromatogram of test solution in negative ion mode；1.Aflatoxin M1；2.Aflatoxin G2；3.Aflatoxin G1；4.Aflatoxin B2；5.Aflatoxin B1；6.Fumonisin B1；7.Fumonisin B2；8.T-2 Toxin；9.Deoxynivalenol；10.Ochratoxin A；11.Zearalenone.Fig.1 Total ion current chromatograms of mixed reference and test solutions

ME(%)=Ais/Ai

(1)

公式(1)中，Ais为空白提取液系列标准曲线的斜率；Ai为50%甲醇系列标准曲线的斜率，结果见图2。结果表明，AFB1、AFB2、AFG1、T-2、DON等均有明显的基质抑制效应，AFM1、FB1、FB2则表现为基质增强效应。

图2 基质抑制效应(A)和基质增强效应(B)Fig.2 The inhibition(A) and enhancement effect (B) of matrix

为降低基质效应影响，分别精密量取上述混合对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置5 mL量瓶，加空白基质稀释至刻度，摇匀，各进样4 μL，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，以定性离子对的3倍信噪比(S/N)确定化合物的检出限，定量离子对的10倍信噪比确定化合物的定量限，结果见表3。

表3 11种真菌毒素线性方程、相关系数、检出限及定量限Tab.3 Linear equations，correlation coefficients，LODs and LQDs of 11 mycotoxins

2.6加样回收率实验 取同一批藤茶粉末[过三号筛，筛孔内径(355±13) μm]5 g，精密称定，按低、中、高浓度水平分别精密加入混合对照品溶液1，2，4 mL，每个浓度平行3份，按照“2.4”项方法制备供试品溶液进样检测，计算回收率，结果见表4。

表4 11种真菌毒素回收率实验结果Tab.4 Recovery results of 11 mycotoxins n=3

2.7重复性实验 取藤茶粉末[过三号筛，筛孔内径(355±13) μm]5 g，精密称定，共6份。分别精密加入混合对照品溶液1 mL，按“2.4”项方法制备供试品溶液并测定浓度，结果表明方法的重复性良好，见表5。

表5 11种真菌毒素重复性实验结果Tab.5 Repeatability results of 11 mycotoxins n=6

2.8稳定性实验 取同一份供试品溶液，分别于配制后0，2，4，8，12，24 h进样测定，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、FB1、FB2、T-2毒素、ZEN、OTA以及DON峰面积的RSD (n=6)分别为4.19%，6.03%，4.60%，3.64%，3.53%，1.55%，7.24%，7.44%，7.95%，2.23%和4.48%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9样品测定 采用所建立的方法分别测定49批藤茶样品中真菌毒素，其中湖北省10批，福建省9批，重庆市2批，湖南省10批，贵州省4批，广西壮族自治区13批，江西省1批。49批样品中11种真菌毒素均未检出。

3 讨论

真菌毒素常见的提取方式有振摇法、超声法以及高速均质法。振摇法提取耗时较长，提取效率低；超声法提取易发热，且杂质溶出较多。笔者在本研究采用均质法提取，使样品组织和提取溶剂在高速旋转时充分接触，可快速、简单、高效提取出真菌毒素[17]。实验比较了不同浓度甲醇和乙腈的真菌毒素提取效果，结果显示：样品采用80%乙腈提取时，基质效应影响最小，11种真菌毒素均能达到较好回收率，故选用80%乙腈作为提取溶剂。

固相萃取法是真菌毒素检测中常用的非特异性净化方法，本实验采用waters Oasis HLB 型固相萃取小柱，可以满足多成分的提取净化要求，但其保留机制为反相，需要调整上样溶液的极性，将提取溶剂80%乙腈置换成水，才会使目标物在固相萃取小柱上得以保留。藤茶主要含有黄酮类化学成分，其中二氢杨梅素含量最高，为30%～40%[31]，二氢杨梅素易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，在常温或冷水中溶解度较低。在溶剂置换过程中，二氢杨梅素不断沉淀析出，对真菌毒素的富集净化有一定的影响。经过反复实验，最终采用80%乙腈溶液提取，加水稀释后取20 mL减压浓缩至约5 mL，放冷，离心，孔径0.22 μm滤膜滤过后，再缓慢通过已经活化好的固相萃取柱处理样品，各真菌毒素回收率为69.82%～118.77%。

《中华人民共和国药典》2015年版[7](一部)规定了黄曲霉毒素在中药材中的最高限量标准，即AFB1不得高于5 μg·kg-1，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的总量不得高于10 μg·kg-1，但并未制定其他毒素的限量标准。GB 2761-2017《食品中真菌毒素限量》规定AFB1、AFM1、DON、OTA和ZEN等真菌毒素在谷物、豆类、乳制品及坚果等食物中的限量，但未提及茶叶类制品的限量标准。然而，国内已有学者在普洱茶、红茶、绿茶等茶叶中检出了AFB2、AFG1、和FB1、FB2等[32-34]。虽然本次收集的49批藤茶样品均未检出上述11种真菌毒素，可能是干燥环节杀灭了藤茶中大多数微生物，但目前全国各地的藤茶加工尚无规范统一标准，大部分地区仍以手工小作坊为主，其渥堆过程中温湿度掌握不当，或干燥后在包装、运输和贮藏过程中吸潮，仍可能霉变产生真菌毒素。本研究建立的高效液相色谱-串联质谱法同时测定藤茶中11种真菌毒素的方法，可快速完成中药中常见真菌毒素的定性和定量分析，具有简单快速、准确灵敏、实用性强的特点，为开展藤茶产地加工及贮存过程中的真菌毒素风险评估提供了技术支持。