TLR4/NF-κB信号通路在七氟烷诱导的术后认知功能障碍老年大鼠中的作用

2021-07-06 09:23黄运伯陈素玲黄剑
中国老年学杂志 2021年13期
关键词:氟烷象限海马

黄运伯 陈素玲 黄剑

(海口市人民医院麻醉科,海南 海口 570208)

目前认为术后认知功能障碍(POCD)病理生理机制与神经炎症、氧化应激、细胞凋亡等有关,因此减轻神经炎症、抑制细胞凋亡成为POCD研究途径。Toll样受体(TLR)4/核因子(NF)-κB是介导先天性免疫和炎症反应的通路,且参与海马级联炎症反应〔1〕。七氟烷为临床广泛应用的吸入麻醉剂,被证实可引起POCD的发生〔2,3〕。故本研究建立七氟烷诱导的POCD老年大鼠模型,探讨TLR4/NF-κB信号通路在其中的作用,以期为POCD的机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物 30只SPF级雄性SD大鼠,20月龄,体重500~600 g,购自中国科学院上海药物研究所,SCXK(沪)2020-0005。

1.2药物、主要试剂 七氟烷(上海恒瑞医药有限公司),TLR4抑制剂TAK242(北京百奥博莱科技有限公司),白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉艾美捷生物科技有限公司),TLR2、NF-κB p65一抗,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(CST中国)。SM2010R徕卡切片机(徕卡显微系统贸易公司),Varioskan LUX酶标仪、ABI实时荧光定量PCR仪(赛默飞世尔科技中国)、CheniDoc XRS化学发光成像分析系统(美国Bio-rad公司)。

1.3动物分组及七氟烷诱导POCD模型建立 SD雄性大鼠30只,随机分为对照组、模型组、TLR4抑制组,每组10只。模型建立参考文献〔4,5〕,以戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉,仰卧固定于脑立体定位仪,TLR4抑制组以TAK242 10 μg侧脑脑室注射,其余大鼠侧脑室予以注射等量生理盐水。侧脑室注射10 min后模型组与TLR4抑制组佩戴4%七氟烷+2 L/min O2通气面罩,经腹部正中做3 cm切口,进行腹腔探查,探查结束后以青霉素16 U/kg腹腔注射,术后置入麻醉箱诱导箱中,箱底铺适量钠石灰,通气流量2 L/min,4%七氟烷,七氟烷共持续吸入3 h。对照组不予以腹腔探查,置入麻醉箱中仅吸入空气/氧气混合体。

1.4Morris水迷宫评价大鼠认知功能〔6〕麻醉术后24 h,进行Morris水迷宫实验,圆形水迷宫划分4个象限,任意选择一个象限水面下设置隐蔽平台,将大鼠从4个象限随机放入水中,记录其寻找平台时间(逃避潜伏期),4个象限入水点每天依次训练1次,每次间隔20 min,记录第5天的逃避潜伏期。第6天进行空间探索实验,撤去平台,选择任一象限放入大鼠,记录其60 s内穿越平台位置次数及目标象限停留时间占比。

1.5TUNEL染色观察海马神经元凋亡情况〔7〕Morris水迷宫实验后大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,开胸左心室-主动脉生理盐水及4%多聚甲醛灌流固定,分离新鲜海马组织,以4%多聚甲醛固定48 h,石蜡包埋,制成3 μm厚度切片,根据TUNEL试剂盒说明书操作,显微镜下随机选取5个视野,计算阳性细胞数,以棕黄色细胞颗粒为阳染,以阳性细胞占细胞总数的比率表示凋亡率。

1.6ELISA检测海马IL-1β、IL-6、TNF-α水平〔8〕海马组织加入细胞裂解液及蛋白酶抑制剂研磨,10 000 r/min离心0.5 h(4℃),去上清液,二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量,根据ELISA试剂盒说明书操作,于450 nm的酶标仪上读取吸光度值,对应标准曲计算IL-1β、IL-6、TNF-α浓度。

1.7实时荧光定量PCR检测海马组织TLR4、NF-κB p65 mRNA表达 海马组织液氮中研磨,提取总RNA,逆转录试剂盒获得cDNA,构建PCR体系,严格按照试剂盒说明书操作,以β-actin为管家基因,2-△△Ct法计算TLR4、NF-κB p65 mRNA表达水平。引物序列:TLR4:上游引物5′-AGCTGAGTTCGTGTGTTACGT-3′,下游引物5′-GCATGATGTGTGCCGTGATTG-3′;NF-κB p65:上游引物5′-TTGCAGCGTAAGTTGTTC-3′,下游引物5′-CGTAGTCGTAGCTGCGCG-3′;β-actin:上游引物5′-AGTATTCTGGCGTAGCTCGACTC-3′,下游引物5′-TAGTGTCTGAGCTTAGATCGGTA-3′。

1.8Western印迹检测大鼠海马组织TLR4、NF-κB p65蛋白表达〔7〕剩余海马组织提取蛋白总量,BCA法鉴定蛋白浓度,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转膜、封闭,添加TLR4(1∶500)、NF-κB p65(1∶500)一抗稀释液,4℃摇床孵育过夜,加入封闭液稀释二抗(1∶5 000),常温孵育0.5 h,暗室中曝光、显影及定影,Image 软件分析条带灰度值,以目的蛋白与内参β-actin蛋白条带灰度值比值为蛋白相对表达量。

1.9统计学分析 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析、采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1逃避潜伏期、穿越平台次数与目标象限停留时间占比比较 与对照组比较,模型组逃避潜伏期延长,穿越平台次数与目标象限停留时间占比减少,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,TLR4抑制组逃避潜伏期缩短,穿越平台次数与目标象限停留时间占比增加,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组逃避潜伏期、穿越平台次数与目标象限停留时间占比、海马区神经元凋亡数量及IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较

2.2海马区神经元凋亡率比较 与对照组比较,模型组神经元凋亡率增加,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,TLR4抑制组神经元凋亡率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3海马区IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较 与对照组比较,模型组IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,TLR4抑制组IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.4海马组织TLR4、NF-κB p65 mRNA表达比较 与对照组比较,模型组TLR4、NF-κB p65 mRNA相对表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,TLR4抑制组TLR4、NF-κB p65 mRNA相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 TLR4、NF-κB p65 mRNA相对表达量比较

2.5海马组织TLR4、NF-κB p65 蛋白相对表达量比较 与对照组比较,模型组TLR4、NF-κB p65蛋白相对表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,TLR4抑制组TLR4、NF-κB p65蛋白相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、图1。

表3 TLR4、NF-κB p65 蛋白相对表达量比较

1~3:对照组、模型组、TLR4抑制组图1 各组蛋白Western印迹

3 讨 论

七氟烷是新型的卤代羟基醚类吸入式全麻药物,具有诱导迅速、苏醒快、麻醉深度易调节、对呼吸及循环抑制轻等优势,是全麻诱导的首选药物〔9〕。研究表明,吸入麻醉引起的神经毒性和老年认知功能的衰退有关,但其具体机制仍有待探讨〔10〕。

本研究结果提示模型建立成功;七氟烷诱导的POCD与海马区炎症反应诱导的神经细胞凋亡有关。海马区是大脑负责记忆存储转换与定向等功能的重要区域,在炎症、氧化应激等病理条件刺激下可导致神经细胞损伤,出现学习、记忆、定向能力异常等认知功能障碍相关症状〔11〕。研究发现〔12〕,七氟烷能促进海马区域β淀粉样蛋白的寡聚化,而β淀粉样蛋白可刺激胶原细胞分泌和释放IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症细胞因子,产生神经毒性,导致神经元的变性坏死。另有研究证实〔13〕,七氟烷麻醉能加重内质网应激钙超载,促进海马神经元凋亡,加重创伤性脑损伤大鼠认知功能障碍。以上述研究均说明七氟烷诱导的POCD与海马区炎症反应诱导的神经细胞凋亡有关。

TLR4是白细胞介素受体家族成员,能激活NF-κB产生免疫炎症,在神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞中均有表达〔14〕。NF-κB是TLR4/NF-κB信号通路下游的关键转录因子,其激活后能分泌促炎细胞因子,启动获得性免疫反应〔15〕。Liu等〔16〕研究发现TLR4/NF-κB信号通路参与糖尿病认知功能障碍的发生。Jin等〔17〕通过动物实验发现抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活可抑制小胶质细胞诱导的神经炎症,减轻神经细胞损伤。本研究结果提示七氟烷诱导的老年大鼠POCD与TLR4/NF-κB信号通路的激活有关。

综上,TLR4/NF-κB信号通路的激活参与七氟烷诱导老年大鼠POCD的发生,在POCD的治疗研究中可考虑将TLR4/NF-κB信号通路作为切入点。

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