不同孕周母亲及其新生儿血氨基酸代谢谱变化特点

钟凯苑 杨秋萍 郭微 李菲 石聪聪 李思涛 肖昕 李思平

1佛山市三水区妇幼保健院产科，广东 528100；2中山大学附属第六医院儿科，广州 510000；3佛山市三水区妇幼保健院儿科，广东 528100

妇女妊娠期间，在身体结构、生理和生物化学等方面会发生复杂的改变，孕妇在妊娠期身体成分及代谢的改变将影响胎儿的生长发育，并影响妊娠结局。受孕产物、子宫和母体的血液中，蛋白质的含量比脂肪、碳水化合物的含量更为丰富［1］。足月时，胎儿及胎盘的总重量约4 kg，其中包含约500 g的蛋白质，占妊娠造成蛋白质增加的一半［2］。由此可见，妊娠期蛋白质代谢至关重要。本研究基于MS/MS的代谢组平台，对不同孕周母亲及其新生儿血氨基酸进行检测分析，探讨不同孕周母亲及新生儿氨基酸代谢特点，为孕期营养补充提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取佛山市三水区妇幼保健院和中山大学附属第六医院产科、新生儿科2017年11月至2020年7月住院的健康妊娠妇女143例（年龄范围21～35岁）及其所生新生儿143例（胎龄范围28～41周），分为3组：＜32周，22例；32～36+6周，59例；≥37周，62例。所有孕妇无妊娠期合并症或遗传性高血脂、糖尿病、甲减、肝脏病或肾脏病病史。3组产妇一般临床资料比较差异均无统计学意义，具有可比性。本研究获得佛山市三水区妇幼保健院医学伦理委员会、中山大学附属第六医院医学伦理委员会的批准，所有血液样本获得孕妇的知情同意。

1.2 样本收集 在孕妇及家属了解和签署遗传代谢病疾病筛查知情同意书后，对孕妇及其所生新生儿进行血标本采集。干血片采集：在孕妇生产前、新生儿生后1 d内进行采血，对采血指尖/足跟进行消毒，使用采血针进行采血，血滴自然渗透滤纸，连续采集3个血斑，每个血斑直径大于8 mm，且滤纸正反面完全充分渗透，以保证血浓度均匀一致且无渗血环。样本存放及检测：采血完毕后把血片平放在阴凉清洁地方进行自然晾干，同时避开紫外线、阳光照射及外源污染，干燥后的血片经检查合格后置于密封袋内，于2～8℃冰箱中保存，于1周内在中山大学附属第六医院遗传代谢病实验室进行检测。

1.3 检测方法 血串联质谱检测仪器为Waters超效液相色谱（I-class）串联质谱仪（Xevo-TQD，美国生物应用系统公司），采用琥珀酰丙酮和多种氨基酸、肉碱测定试剂盒进行非衍生化，干滤纸血片经打孔后加入含100μl内标的萃取液（甲醇∶超纯水=8∶2），放入微孔板震荡器以700转/min、45℃条件下振荡45 min后，室温静置5 min，取上清液75μl放于96孔耐热V底板中，铝膜覆盖后上机检测。

1.4 数据采集与分析 根据质谱峰的m/z进行定性，采用定量分析软件自动计算出所测样品氨基酸代谢产物的浓度值，利用SIMCA 14.0数据处理软件，采用正交偏最小二乘判别分析法（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）对孕妇血氨基酸代谢物质进行分析并寻找关键差异代谢物。评价OPLS-DA模型匹配度的3个关键指标（R2X表示X矩阵解释率；R2Y代表Y矩阵解释率，二者共同反应模型稳定性；Q2代表模型预测性，3者都大于0.5表明模型匹配良好，越接近1说明模型的匹配度越高）。根据OPLS-DA模型所有变量S-plot图越偏向两端的物质，其协方差和相关性越大，以此筛选差异代谢物。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.5 差异物质筛选标准 根据模型所得的变量权重图（variable importance plot，VIP）寻找差异代谢物，选取VIP＞1的代谢物。

2 结 果

2.1 不同孕周母亲及新生儿血氨基酸代谢谱分析结果 为了消除非必要因素作用的影响，完成两组间最大化分离，寻找权重较大的差异代谢物，利用有监督OPLS-DA的方法去除与样品分组无关的信息，分析不同孕周母亲及新生儿血氨基酸代谢全谱。

2.1.1 不同孕周母亲血氨基酸代谢谱分析结果 图1为不同孕周母亲血氨基酸代谢全谱数据的OPLS-DA得分图。由图1可看出，早产组与足月组母亲血氨基酸水平分布在两个区域，表明早产组与足月组母亲血氨基酸水平差异有统计学意义。而早产两组母亲（＜32周与32～36+6周）血氨基酸分布在同一个区域，表明不同孕周的早产组母亲血氨基酸水平差异无统计学意义。

图1 不同孕周母亲血氨基酸水平OPLS-DA聚类图

2.1.2 不同胎龄新生儿血氨基酸代谢谱分析结果 图2为不同胎龄新生儿血氨基酸代谢全谱数据的OPLS-DA得分图。由图2可看出，早产组与足月组新生儿血氨基酸水平分布在两个区域，表明早产组与足月组新生儿血氨基酸水平差异有统计学意义。而早产两组新生儿（＜32周与32～36+6周）血氨基酸分布在同一个区域，表明不同胎龄的早产新生儿血氨基酸水平差异无统计学意义。

图2 不同胎龄新生儿血氨基酸水平OPLS-DA聚类图

2.2 不同孕周母亲及新生儿血氨基酸差异物质分析变量重要性得分图是使用OPLS-DA模型进行有监督性分析方法中评价变量贡献最常用的方法，根据VIP大于1.0对差异有统计学意义的物质进行筛选。本研究不同孕周母亲及新生儿血氨基酸23个物质，经OPLS-DA模型分析后，不同孕周母亲获得丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸共6种权重大于1的差异代谢物（图3）；不同胎龄新生儿获得脯氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、组氨酸共5种权重大于1的差异代谢物（图4）。

图3 不同孕周母亲血氨基酸权重图（权重大于1）

图4 不同胎龄新生儿血氨基酸权重图（权重大于1）

2.3 不同孕周母亲及新生儿血氨基酸差异物质水平对不同孕周母亲及新生儿进行代谢组学分析，分别得到6个、5个差异代谢物，这些氨基酸水平数值见表1、2。由表中数据可看出，与孕周不足月的母亲相比，孕周足月母亲的丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸水平升高；新生儿组有5个权重较大的物质，与早产新生儿相比，足月新生儿谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸水平升高，而脯氨酸、组氨酸水平降低。

表1 不同孕周母亲血氨基酸差异物质水平（μmol/L，±s）

表1 不同孕周母亲血氨基酸差异物质水平（μmol/L，±s）

组别＜32周32～36+6周≥37周F值P值例数22 59 62丙氨酸139.12±20.00 137.59±27.72 244.67±84.83 56.86＜0.001甘氨酸129.52±35.00 117.59±24.81 165.76±61.67 17.45＜0.001谷氨酸193.51±25.52 188.05±40.25 238.40±73.79 13.43＜0.001脯氨酸99.94±18.92 104.69±20.83 137.41±41.31 20.98＜0.001缬氨酸83.60±12.96 84.76±13.11 112.17±25.63 35.29＜0.001亮氨酸93.82±20.06 94.65±18.28 112.62±35.94 7.64 0.001

3 讨 论

近年来，串联质谱技术发展迅速，有灵敏度高、特异性高和检测快速的优点［3-4］。国内外有多篇研究应用该技术对尿液、血液、羊水和细胞等样本中的氨基酸、有机酸、脂肪酸和类固醇激素等代谢物进行检测［5-6］，能更早期、精准地识别和预测某些疾病，对减少疾病严重程度和并发症的发生至关重要。因此，本研究基于MS/MS的代谢组平台，对不同孕周的母亲及其新生儿血氨基酸进行分析，研究血氨基酸水平的差异，帮助评估在不同孕周母亲及新生儿血氨基酸代谢的状态，为进一步的营养补充提供参考。

表2 不同胎龄新生儿血氨基酸差异物质水平（μmol/L，±s）

表2 不同胎龄新生儿血氨基酸差异物质水平（μmol/L，±s）

组别＜32周32～36+6周≥37周F值P值例数22 59 62脯氨酸431.63±235.66 571.62±228.19 190.83±117.11 61.88＜0.001谷氨酸151.40±34.43 177.98±44.23 319.06±104.78 67.89＜0.001甘氨酸144.84±48.13 172.51±44.88 277.98±129.10 27.27＜0.001丙氨酸184.11±54.80 201.22±50.75 307.47±127.38 25.42＜0.001组氨酸150.78±103.77 143.15±90.69 34.00±15.87 42.42＜0.001

本研究发现，在母亲方面，孕周足月母亲的丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸水平高于孕周不足月母亲；在新生儿方面，足月新生儿的谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸水平高于早产新生儿，脯氨酸、组氨酸水平低于早产新生儿。然而不论是母亲还是新生儿，孕32周前与32～36+6周的血氨基酸水平比较差异有统计学意义，这提示早产与足月的母亲/新生儿的氨基酸代谢差异有统计学意义，主要集中体现在上述7种氨基酸。

丙氨酸是一种生糖氨基酸，在人体内最经典的代谢途径为丙氨酸-葡萄糖循环，在肝脏丙氨酸能够迅速转化葡萄糖为机体供能［7］，足月时母亲及新生儿的丙氨酸水平升高，提示足月时胎儿发育对葡萄糖的需求更大，需要更高的丙氨酸进行糖异生提供能量。

甘氨酸是结构最简单的一种人体非必需氨基酸，研究认为甘氨酸可用于血红素、蛋白质、核酸的生物合成［8］，还能够调节细胞因子、超氧化物的产生和免疫功能［9］，另外甘氨酸还是抑制性神经递质［10］，因此甘氨酸在生物合成、抗氧化反应、神经调节等方面具有重要作用，足月时母亲及新生儿的甘氨酸水平均升高，提示可能足月时胎儿进行大量的蛋白合成、体内代谢活跃、存在氧化应激，需要更多的甘氨酸。

谷氨酸是一种酸性氨基酸，是中枢神经系统含量最多的氨基酸，参与诱导突触形态及功能的变化、影响自主运动神经系统。谷氨酸不能透过血脑屏障，饮食中的谷氨酸主要为肠细胞代谢，为肠上皮细胞的主要能源物质［11］。有研究者提出胎盘和胎儿肝脏之间的Glu-Gln循环假说，谷氨酸和谷氨酰胺是胎盘和胎儿肝脏能量的主要来源，可以为嘌呤合成提供氮源［12］。研究发现，宫内生长迟缓的母体谷氨酸浓度显著降低［13］。本研究中足月母亲及新生儿的谷氨酸水平均升高，提示谷氨酸对胎儿体质量、神经发育、代谢具有重要意义。

脯氨酸是一种环状的亚氨基酸，在蛋白合成、抗氧化、机体新陈代谢等方面具有重要调控作用，研究发现适量添加脯氨酸可以促进胚胎、胎盘、孕体的生长发育［14］。组氨酸被称为半必需氨基酸，由于仅依靠体内合成而不从食物摄取则无法满足机体生长需要，因此组氨酸对婴幼儿的生长发育也至关重要。本研究中，脯氨酸水平在足月母亲体内水平升高，而在足月新生儿体内水平降低，表明孕足月时胎儿生长发育迅速，对脯氨酸需求高，足月新生儿由于其自身大量消耗，而此时摄入相对不足，使得体内脯氨酸及组氨酸水平降低。

对比母婴上述几种差异权重较大的氨基酸水平，发现脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸在新生儿中的水平均高于孕母，尤其是脯氨酸；而新生儿谷氨酸水平低于孕母。这提示胎儿在整个发育过程中，需要大量氨基酸的供给以完成蛋白合成、新陈代谢、自身生长发育，因此在母婴之间多种氨基酸呈现主动转运过程。而谷氨酸虽然是神经系统发育的重要氨基酸，但有研究提示过高的谷氨酸会导致神经毒性，其水平是判断缺氧缺血性脑病病情严重程度及预后的客观指标［15-16］，因此新生儿谷氨酸水平低于孕母。

在漫长的妊娠周期，孕妇各个器官都由于妊娠而产生巨大变化，但目前尚未有研究探讨妊娠期妇女及其新生儿的代谢情况，本研究对不同孕周母亲及其新生儿血氨基酸水平进行检测，发现早产与足月的母亲/新生儿的氨基酸代谢有明显差异，可初步评估母婴血氨基酸代谢情况，为妊娠期营养或新生儿期营养提供参考，助力于孕体及胎儿的健康生长发育。孕母与新生儿血氨基酸的转运通路及机制尚不明确，有待更深入的分子研究。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。