新生儿B族链球菌ST17型感染的临床特征和相关毒力基因检测

麦荣嘉 李碧婷 马丹娟 欧阳凯 邓文喻 穆小萍

广东省妇幼保健院，广州 510010

B族链球菌（group B streptococcus，GBS）是新生儿感染的重要致病菌之一，可见于软组织感染、菌血症、肺炎、尿路感染和脑脊液等［1］。GBS所致的新生儿脑膜炎发病急且病情严重、病死率高，部分患儿愈后可出现失明、失聪、智力下降或运动障碍等后遗症［1-2］。在GBS侵袭性感染临床分离株中最常见的基因型为ST1、10、17和19，其中ST17型具有较高分离率，并且有较强的致病性［3-4］。近年来，新生儿ST17型GBS感染逐渐引起国内外医学界的重视，但相关研究资料较少，本研究拟通过收集广东省妇幼保健院2017至2019年新生儿ST17型GBS感染的临床特征，探讨ST17型的临床特点与毒力基因的关系，以便临床快速诊断和合理运用抗菌药物。

1 资料与方法

1.1 一般资料 以本院2017年1月至2019年9月发生B族链球菌感染的新生儿为研究对象，共27例。纳入标准：发病年龄在0～28 d之间的新生儿；败血症或化脓性脑膜炎，诊断标准参照《实用新生儿学》（第5版）。排除标准：分娩期间的外伤；因手术后或外伤引起的败血症；有遗传综合征与重大先天性异常。

1.2 数据收集 对符合纳入标准的27例新生儿的临床资料进行收集整理，包括：标本来源、新生儿出生资料、起病日龄［早发型败血症（early onset sepsis，EOS）和晚发型败血症（late onset sepsis，LOS）］、外周白细胞、C-反应蛋白（CRP）和降钙素原（PCT）、血培养病原菌的病原鉴定及药敏结果、脑脊液常规和生化检查、病情转归及预后情况等。

1.3 研究方法

1.3.1 GBS培养、鉴定和药物敏感试验 所有操作严格按照《全国临床检验操作规程》（第4版）执行。将接种至5%羊血琼脂平板，35℃，5%CO2培养18～20 h，通过菌落形态、涂片镜检、CAMP试验进行初筛后，使用MALDI-TOF和VITEK 2 COMPACT全自动细菌鉴定GBS，并使用药敏分析系统对GBS的药物敏感分析。根据美国临床和实验室标准协会指南2020版M-100（2020 CLSI M-100）作为药物敏感性试验判读标准。

1.3.2 血清分型 Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和V 5种乳胶凝集分型血清（Strep-B-Latex®rapid latex agglutination test kit）购自 丹 麦 血 清 研 究 所（Statens serum institute，Hillerød，Denmark），按其操作步骤及判读方法进行分型［3］。根据血清型分组，血清Ⅲ型组和其他型组。

1.3.3 GBS的多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）参考文献设计GBS管家基因引物adhP、pheS、atr、glnA、sdhA、glck和tkt［5］，引物由上海生工公司合成。PCR产物经纯化后由广州艾基生物技术有限公司测序，应用DNAMAN软件与MLST官网（http：//www.mlst.net/）公布的MLST各管家基因的标准序列及型别进行比对分析。

1.3.3 毒力基因的检测参考文献设计无乳链球菌毒力基因（fbsA、ScpB、lmb、hylB）引物［6-9］。引物序列及PCR反应条件见表1。

表1 无乳链球菌毒力基因引物

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0软件对数据进行分析和处理。符合正态分布的计量资料组间采用独立样本t检验，而不符合正态分布采用秩和检验；计数资料采用Fisher确切概率法检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况及临床特征 比较血清Ⅲ型组和其他型组新生儿的临床资料，性别、出生体质量、白细胞计数、CRP及住院天数，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；EOS、LOS、PCT、脑脊液葡萄糖以及脑脊液蛋白发生情况比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；见表2。

表2 血型Ⅲ组与其他型组感染B族链球菌新生儿的临床资料比较

2.2 GBS的血清分型 血清Ⅲ型15株（55.6%）；其他型组中：Ⅰa型1株（3.7%）、Ⅰb型3株（11.1%）、Ⅱ型5株（18.5%）和Ⅴ型3株（11.1%），见图1。

2.3 GBS的MLST分型 本研究对引起新生儿临床感染的27株GBS进行MLST分型。根据测序结果，血清Ⅲ组：ST17型11株、ST19型3株和ST27型1株，其他型组：Ⅰa型有ST103型1株、Ⅰb型有ST12型3株、Ⅱ型有ST10型4株和ST28型1株、Ⅴ型有ST1型3株，见图1。

图1 无乳链球菌血清型和MLST型的分布

2.4 毒力基因检测 27株无乳链球菌均检出毒力基因scpB和hylB；血清Ⅲ组中ST19和ST27均未检出fbsA，其他型组GBS检出率为50.00%（6/12）。lmb在血清Ⅲ组和其他型组的检出率分别为86.67%（13/15）和83.33%（10/12）。血清Ⅲ组中ST17型（11株）均能检出fbsA、scpB、lmb、hylB。

2.5 药敏试验 27株GBS菌株对青霉素类（如青霉素、氨苄西林）、头孢菌素类（头孢曲松）、万古霉素和利奈唑胺100.00%敏感。

2.6 治疗和转归 27例新生儿中有26例治愈或好转出院，1例死亡，属于血清Ⅲ型组中的ST17型。

3 讨 论

GBS常定植于女性泌尿生殖道中，在妊娠妇女分离病原菌中分离率高，并且可以通过产道引起新生儿EOS和LOS感染，是国内外新生儿面临的严峻问题。尽管美国CDC制定的《围生期B族链球菌疾病预防指南》以及GBS筛查执行在临床中应用使GBS的EOS的感染率明显下降，但是LOS感染有起病隐匿和症状不典型等特点而容易被忽视［10-13］。新生儿感染GBS最常见的疾病表现是重症肺炎、败血症和化脓性脑膜炎，而GBS所致的化脓性脑膜炎主要表现为LOS，其中血清Ⅲ型感染占多数［1，10］。本研究发现，GBS-LOS以化脓性脑膜炎为主要临床表现，而感染血清Ⅲ型更容易引起脑膜炎的临床症状；血清Ⅲ型感染更具有侵袭性，尤其血清Ⅲ型中的ST17，上述结果与文献报道相符。

GBS的致病性主要取决于其多种毒力因子编码毒性蛋白的相互作用［1］，其中高毒黏附素（hypervirulent adhesin，HvgA）就是一种特殊的上皮细胞壁锚定蛋白。有研究表明，基因型ST17具有的HvgA具有强侵袭功能，与新生儿脑膜炎相关［1，10］。本研究结果显示血清Ⅲ型感染引起的脑膜炎比其他型组高，同时脑脊液的葡萄糖降低以及蛋白的升高的变化明显比其他型组的多；脑脊液生化变化在血清Ⅲ型中的ST17尤为突出，说明ST17更容易引起新生儿的脑膜炎。除HvgA以外，参与宿主细胞粘附的毒力因子还有fbsA、scpB、lmb等［6-8］，而hylB参与透明质酸酶的形成［9］，而本研究11株ST17均检出4种毒力基因，这进一步提示ST17具有强侵袭能力。

根据2020 CLSIM-100标准，脑脊液分离株不应该使用第1、2代头孢菌素及头霉素、克林霉素、大环内酯类、四环素类以及氟喹诺酮；由于第3代头孢菌素类（头孢曲松或头孢塞肟）较青霉素类较易穿透血脑屏障并且其低不良反应发生率优于万古霉素，所以针对GBS强毒株感染的新生儿，临床推荐应使用头孢菌素类进行治疗，预防和治疗GBS的化脓性脑膜炎。

综上所述，本研究分析了27株GBS在新生儿感染的血清分型分布，其基因型存在差异，ST17占总数的40.74%；结合病例的临床数据分析，ST17是导致患儿侵袭性感染的主要基因型，并且与GBS脑膜炎的发病密切相关。目前MLST是基于基因水平对多个管家基因核苷酸序列进行细菌基因分型的方法，虽然已应用于GBS的遗传水平研究，但是由于实验繁琐并未在临床鉴定中得到应用。建立适用临床的GBS基因分型，对预防治疗新生儿以及孕妇围产期的感染是否有积极的意义，有待进一步研究。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。