草果挥发油诱导鼻咽癌6-10B细胞凋亡的机制研究

高鸣乡，蒋佩文，李敏惠，杨 平，代 敏

1成都医学院临床医学院；2成都医学院基础医学院；3成都医学院科研实验中心；4成都医学院检验医学院,成都 610500

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是常见的恶性肿瘤之一。国际癌症研究机构(International Agency For Research on Cancer，IARC)估计，2020年全球将有910,677例新增的NPC病例，且763 570 000例患者或将死于这种癌症[1]。据WHO统计，约80%NPC发生在中国，严重危害人民健康和生命安全，是中国重点防治的恶性肿瘤之一[2]。目前，放射和化学药物治疗是其主要的治疗手段，而局部复发及远处转移又是治疗失败的主要原因[3]；治疗鼻咽癌的药物主要有紫杉醇类、顺铂、5-氟尿嘧啶、西妥昔单抗[4,5]等，但这些抗肿瘤药物多为非特异性药物，伴有淋巴细胞减少、黏膜炎、咽喉/口腔疼痛、贫血、皮疹等毒副作用[6]。因此，为了更有效的治疗鼻咽癌，学者们致力于靶向性强、毒副作用小的抗鼻咽癌的新型天然药物研发。

草果(AmomumtsaokoCrevost et Lemaire)为姜科豆蔻属植物草果的干燥成熟果实，主产于广西、云南、贵州等地，是我国重要的药食两用植物[7]；中医认为其具有燥湿温中、截疟除痰的功效，主治寒湿内阻，痞满呕吐，疟疾寒热，瘟疫发热等症状，广泛用于治疗痔疮、咽喉感染、消化系统疾病、恶心和腹痛等病症[8,9]。现代研究表明，草果具有降脂、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、防霉和抗炎镇痛等生物活性[10]。草果挥发油作为草果重要的活性成分，其包含1，8-桉叶素、α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸香叶酯、芳樟醇、反-橙花叔醇、β-月桂烯等，具有抗氧化、调节胃肠、抗菌、抗肿瘤及改变药物通透性等生物活性[11]，但其在抗肿瘤活性方面的研究较少，目前仅有草果挥发油抗肝癌的研究[12]，而关于草果挥发油抑制鼻咽癌的相关研究尚无报道。基于此，本研究拟通过探讨草果挥发油对鼻咽癌6-10B细胞增殖的抑制作用，阐释其作用机制，为草果挥发油在抗鼻咽癌等肿瘤的开发与应用提供科学依据。

1 实验材料

1.1 药物

草果购自北京同仁堂，产于云南，由成都医学院生药学专家李弈教授鉴定为草果(AmomumtsaokoCrevost et Lemaire)。

1.2 肿瘤细胞

鼻咽癌6-10B细胞，四川大学生物治疗国家重点实验室馈赠，已在原实验室完成细胞STR鉴定，保存于成都医学院科研实验中心。

1.3 主要试剂

胎牛血清(Cat.No.10100147)、DMEM基础培养基(Cat.No.11965-092)(Gibco公司)；CCK-8检测试剂盒(Cat.No.CK04)(日本同仁化学研究所)；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(Cat.No.KGA108-2)(凯基生物公司)；线粒体膜电位检测试剂盒(Cat.No.MAK160)、蛋白酶抑制剂Cocktail(Cat.No.11206893001)(Roche公司)；通用蛋白裂解液(百泰克生物公司)；BCA蛋白定量试剂盒(Cat.No.7780)、抗GAPDH(Cat.No.5174)、促凋亡及抗凋亡BCL-2家族抗体试剂盒(Cat.No.5023、Cat.No.2933、Cat.No.4223、Cat.No.2764)、抗Caspase-3(Cat.No.14220)、抗PARP(Cat.No.9542)、抗Caspase-7/9(Cat.No.12827、Cat.No.9502)、抗cleaved Caspase-7/9抗体(Cat.No.8438、Cat.No.52873)和羊抗兔IgG抗体(Cat.No.7074)(Cell Signaling Technology公司)。

1.4 主要仪器

CO2培养箱和生物安全柜(Thermo公司)；低温离心机和高速离心机(Eppendorf公司)；水平离心机(浙江湘仪公司)；超纯水机Direct Q5(Millipore公司)；酶标仪(Bioteke公司)；流式细胞仪NovoCyte(ACEA公司)。

2 实验方法

2.1 草果挥发油的提取及其制备

草果挥发油采用水蒸气蒸馏法提取[13]，密度ρ=929 mg/mL。采用吐温-80进行乳化，乳化后用无菌超纯水进行稀释。

2.2 草果挥发油对鼻咽癌6-10B细胞的增殖抑制试验

预试验筛选草果挥发油抑制鼻咽癌6-10B细胞增殖活性的浓度，确定具有增殖抑制活性的5个不同浓度(0.058、0.12、0.23、0.46和0.93 mg/mL)。采用上述5个不同浓度的草果挥发油处理鼻咽癌6-10B细胞24 h，CCK-8法[14]检测草果挥发油对鼻咽癌6-10B细胞的抑制情况，并用GraphPad Prism 7绘制鼻咽癌6-10B细胞的生长抑制曲线。

2.3 草果挥发油诱导鼻咽癌6-10B细胞凋亡检测

用上述5个不同浓度草果挥发油处理鼻咽癌6-10B细胞24 h，倒置显微镜下(20×物镜)观察鼻咽癌6-10B细胞形态变化。综合分析细胞增殖抑制活性、细胞毒性和形态学结果，选择明显引起细胞凋亡的3个不同浓度草果挥发油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)处理，探讨其作用机制。采用Annexin V/PI双染法[15]，通过流式细胞仪检测经3个不同浓度草果挥发油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)处理鼻咽癌6-10B细胞24 h后，对鼻咽癌6-10B肿瘤细胞的凋亡诱导效应，以未处理组为空白对照。

2.4 草果挥发油作用鼻咽癌6-10B细胞后线粒体膜电位检测

JC-1是一种用于检测线粒体膜电位的阳离子亲脂性荧光探针[16]，可通过流式细胞仪检测胞内荧光强度来监测线粒体膜电位的改变。3个不同浓度草果挥发油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)处理鼻咽癌6-10B细胞24 h，JC-1染色，流式细胞仪检测鼻咽癌6-10B细胞线粒体膜电位的变化情况，以未处理组为空白对照。

2.5 草果挥发油诱导鼻咽癌6-10B细胞凋亡的蛋白检测

3个不同浓度的草果挥发油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)处理鼻咽癌6-10B细胞24 h后，采用Western blot法[17]，分析凋亡通路相关蛋白PARP、Caspase-3/7/9及其cleaved片段，以及线粒体途径凋亡相关蛋白Bax、Bim、Bcl-2、Bcl-xL等表达情况，以未处理组为对照。

3 实验结果

3.1 草果挥发油对鼻咽癌6-10B细胞的增殖抑制作用

结果显示，草果挥发油对鼻咽癌6-10B细胞具有增殖抑制作用，且呈剂量依赖性，24 h的IC50为0.14 mg/mL(见图1)。

图1 草果挥发油对鼻咽癌6-10B细胞的生长抑制曲线Fig.1 Growth inhibition curve of nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells treated by A.tsaoko essential oil

3.2 草果挥发油诱导鼻咽癌6-10B细胞凋亡

3个不同浓度草果挥发油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)处理后，鼻咽癌6-10B细胞可见典型的细胞凋亡现象，即细胞皱缩、变圆，核染色质致密深染，形成致密质块，细胞膜完整但出现发泡现象，晚期可见凋亡小体(见图2B)。而草果挥发油在较高浓度(0.93和0.46 mg/mL)呈细胞毒性作用，鼻咽癌6-10B细胞呈现死亡现象，贴壁细胞出现完全脱落、变形和膜破裂(见图2C)。

图2 草果挥发油诱导鼻咽癌6-10B细胞形态学变化Fig.2 Morphological change on nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells induced by A.tsaoko essential oil注：A：空白对照组；B：0.23 mg/mL草果挥发油；C：0.46 mg/mL草果挥发油。Note:A:Blank control;B:0.23 mg/mL A.tsaoko essential oil;C:0.46 mg/mL A.tsaoko essential oil.

形态学结果显示，高浓度(0.93 mg/mL和0.46 mg/mL)草果挥发油使6-10B细胞破碎裂解，发挥明显的细胞毒作用；而在较低浓度(0.23、0.12和0.058 mg/mL)草果挥发油作用下，鼻咽癌6-10B细胞呈现凋亡诱导现象。进一步用Annexin V/PI双染法、流式细胞术验证药物的凋亡诱导效应，结果显示：不同浓度草果挥发油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)对鼻咽癌6-10B细胞具有明显诱导肿瘤细胞凋的作用，其中凋亡细胞所占比例分别为47.51%、33.91%、23.22%(对照组为2.76%)，呈典型剂量依赖性(见图3)。

图3 草果挥发油对鼻咽癌6-10B细胞的凋亡诱导作用Fig.3 Apoptosis in nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells induced by A.tsaoko essential oil注：A：不同浓度草果挥发油作用6-10B细胞 24 h后的凋亡检测图；B：凋亡率的统计学分析(*P<0.05)。Note:A is the apoptosis detection diagram of 6-10B cells exposed to different concentrations of A.tsaoko essential oil for 24 h;B is a statistical analysis of the apoptotic rate (*P<0.05).

3.3 草果挥发油诱导鼻咽癌6-10B细胞凋亡蛋白改变

用对6-10B细胞具有凋亡诱导效应的草果挥发油作用浓度(0.23、0.12和0.058 mg/mL)处理鼻咽癌6-10B细胞24 h，Western blot法分析凋亡通路相关蛋白PARP和Caspase-3/7/9及其cleaved片段的表达情况。发现鼻咽癌6-10B细胞PARP和Caspase-7/9的cleaved片段表达明显增加，较空白对照组具有统计学意义(*P<0.05)(见图4)。

图4 草果挥发油诱导鼻咽癌6-10B细胞凋亡相关蛋白差异表达Fig.4 Expression of apoptosis-related proteins in nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells induced by A.tsaoko essential oil注：A：草果挥发油作用6-10B细胞24 h后凋亡标志性蛋白表达；B：蛋白表达的数据统计学分析(*P<0.05)。Note:A shows the expression of apoptotic marker proteins after treatment with Amomum tsaoko essential oil was applied to 6-10B cells for 24 h;B is the data statistical analysis of protein expression (*P<0.05).

3.4 草果挥发油通过线粒体途径诱导鼻咽癌6-10B细胞凋亡

JC-1染色和流式检测细胞线粒体膜电位(MMP)，发现草果挥发油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)作用6-10B细胞24 h后，药物组较对空白照组(2%)的线粒体膜电位明显改变，其比例分别为：32.68%、43.24%和8.22%，具有统计学意义(P<0.05)(见图5)。提示线粒体凋亡途径极有可能参与了草果挥发油诱导的鼻咽癌6-10B肿瘤细胞凋亡过程。

图5 草果挥发油诱导鼻咽癌6-10B细胞的线粒体膜电位改变Fig.1 The change of mitochondrial membrane potential in nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells induced by A。 tsaoko essential oil注：A：草果挥发油作用6-10B细胞24 h后的线粒体膜电位变化趋势；B：线粒体膜电位改变的统计学分析(*P<0.05)。Note:A shows the change trend of mitochondrial membrane potential of 6-10B cells after 24 h treatment with A.tsaoko essential oil;B is a statistical analysis of changes in mitochondrial membrane potential (*P<0.05).

Western blot进一步分析线粒体凋亡途径相关蛋白Bax、Bim、Bcl-2、Bcl-xL表达情况，结果显示鼻咽癌6-10B细胞经草果挥发油处理后，凋亡蛋白Bax和Bim表达升高，Bcl-2和Bcl-xL表达降低，差异具有统计学意义(*P<0.05)(见图6)。推测线粒体凋亡途径参与了草果挥发油诱导的鼻咽癌细胞凋亡。

图6 草果挥发油诱导鼻咽癌6-10B细胞线粒体途径相关蛋白差异表达Fig.6 Differential expression of mitochondrial pathway-related proteins in nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells induced by A.tsaoko essential oil注：A：草果挥发油处理24 h后6-10B细胞的线粒体途径相关蛋白表达变化；B：蛋白表达数据统计分析(*P<0.05)。Note:A shows the changes of mitochondrial pathway related proteins expression in 6-10B cells after 24 h treatment with A.tsaoko essential oil;B is the statistical analysis of protein expression data (*P<0.05).

4 讨论

鼻咽癌为头颈部上皮细胞恶性肿瘤，其主要病理类型为非角化型未分化癌。早期鼻咽癌单纯放疗效果相对较好，而晚期病变的治疗效果欠佳，所以尝试将放疗和化疗结合用于治疗晚期鼻咽癌[18]。但是，目前常用的化疗药物又存在耐药性和高剂量等缺点[19]。因此，学者们致力于探索天然药物治疗鼻咽癌的效果，研究表明，吐根碱、番茄碱苷和喜树碱等生物碱类化合物，以及肿节风提取物等多种天然产物对鼻咽癌细胞的增殖有一定抑制作用[20,21]。

草果挥发油是草果主要活性成分，具有抗氧化、调节胃肠功能、抗菌、抗肿瘤及改变药物通透性等作用[22]。关于草果挥发油抗肿瘤研究鲜有报道，仅见Zhang[12]报道草果挥发油具有抑制肝癌细胞增殖作用。本研究首次对草果挥发油抑制鼻咽癌细胞的增殖情况进行探讨，结果发现草果挥发油对6-10B细胞有增殖抑制作用，且呈剂量依赖性，24 h的IC50为0.14 mg/mL；同时形态学结果显示，在高浓度(0.93和0.46 mg/mL)草果挥发油的作用下，肿瘤细胞完全破碎裂解，而低浓度(0.23、0.12和0.058 mg/mL)草果挥发油却对鼻咽癌肿瘤细胞6-10B具有明显的凋亡诱导效应。

线粒体途径是细胞凋亡的主要途径之一，线粒体膜电位改变(Δψm)是细胞凋亡的早期标志[16]。本研究发现药物浓度为0.23、0.12和0.058 mg/mL的草果挥发油作用6-10B细胞24 h后，线粒体膜电位明显改变，提示线粒体凋亡途径参与了草果挥发油诱导鼻咽癌细胞凋亡的过程。Bcl-2家族蛋白[23]在线粒体凋亡途径中发挥极为重要的调控作用。外界凋亡刺激因素激活促凋亡因子(如Bax、Bim等)，促使线粒体膜电位改变，导致线粒体膨胀，外膜通透性增加，细胞色素C释放，Caspase-9激活，从而引发Caspase级联反应，导致细胞凋亡。Western blot进一步分析线粒体途径相关蛋白Bax、Bim、Bcl-2、Bcl-xL及凋亡标志性蛋白Caspase-3/7/9、PARP等的表达水平变化，结果进一步证实了草果挥发油通过线粒体凋亡途径诱导鼻咽癌6-10B细胞凋亡。

综上，草果挥发油体外对鼻咽癌细胞有明显增殖抑制作用，可通过线粒体凋亡途径诱导6-10B细胞发生凋亡，进而发挥抗肿瘤生物学效应；课题组后续将深入探讨草果挥发油体内治疗鼻咽癌的疗效及其作用机制，并分析其对其它肿瘤细胞的增殖抑制作用，这些研究将为草果挥发油在后续抗肿瘤天然药物开发与应用提供科学依据，同时也为药食两用植物—草果的综合开发与利用奠定基础。