复方消渴乳膏对糖尿病小鼠糖脂代谢和炎症因子、氧化应激的影响

邹 跃，王 卉，马南行，关云霞，李铭桀，翟 赫，邹吉宇，李姗泽，袁 琦，曹育涵，杨心茹，张秋华

(1辽宁中医药大学基础药理教研室·辽宁 沈阳 110847；2大连麦迪医疗科技有限公司·辽宁 大连 510530)

复方消渴乳膏依据《仁斋直指方》之玉泉丸为基础方药加减配制而成中药乳膏制剂，临床初步观察证明复方消渴乳膏能降低糖尿病患者的空腹血糖、餐后血糖和糖化血红蛋白水平。为了进一步证明其药理作用和作用机制，本文观察其对高脂联合链脲佐菌素(streptozocin，STZ)诱导的糖尿病小鼠血糖、血脂、炎症因子和氧化应激的作用，探讨其对糖尿病作用及作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 C57BL/6J雄性小鼠60只，体质量18～22 g，购自北京科奥协力有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2012-0001。饲养于 SPF 级动物房，室温20 ℃，相对湿度 40%～60%，每日光照 12 h。

1.2 实验药物 复方消渴乳膏：由澳大利亚奥薇纳生物制药有限公司制备。二甲双胍：中美上海施贵宝制药有限公司，批号：H20023370。

1.3 主要试剂 链脲佐菌素(STZ)：购于Sigma公司，STZ 50 mg溶于0.1 mol/L(pH=4.2)柠檬酸钠缓冲液，临用前配制。小鼠超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(T-CHO)、糖基化血红蛋白(GHbA1c)试剂盒：南京建成生物工程研究所；小鼠胰岛素(INS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)酶联免疫分析ELISA试剂盒：江苏酶标生物科技有限公司。高脂饲料(普通饲料77%、蔗糖10%、熟猪油10%、胆固醇2%、胆酸盐1%)：由北京科奥协力有限公司制作。

1.4 主要仪器 TP-100台式精密天平：佑科FA2004；酶标仪：美国Molecular Devices SpectraMax M2；三诺安稳血糖仪；组织切片机：Leica RM2135，Leica 公司，德国；光学显微镜：Olympus。

1.5 方法

1.5.1 模型制备、分组和给药 小鼠适应性饲养2周后，称重，尾静脉采血，检测空腹血糖(FBG)，然后分为正常对照组15只(正常饲料)和造模组45只(高脂饲料)，高脂饲料喂养5周，于造模前禁食15 h，按50 mg·kg-1腹腔注射STZ[1]，连续注射3 d，每周第3天测定小鼠FBG值，最后FBG≧12 mmol·L-1认为糖尿病模型制备成功。造模成功小鼠按体质量随机分为模型组、复方消渴乳膏组、二甲双胍组，上述3组继续以高脂饲料喂养。复方消渴乳膏组同时给予每天0.8 g·kg-1复方消渴乳膏涂抹四肢内侧、腋下、腹股沟处，每天换位；二甲双胍组每天按0.0875 g·kg-1灌胃给药；每天分2次给药，给药12周。实验期间观察并记录小鼠一般情况，包括活动、取食、饮水、精神状况、毛发、粪便等，每周测定FBG并称重，每两周测一次糖耐量(OGTT)。

1.5.2 观察指标及测定 末次给药后，禁食12 h，次日清晨小鼠腹腔注射10 %水合氯醛(350 mg·kg-1)，麻醉后，心脏取血，分离血清。然后，取各组小鼠胰腺，10%多聚甲醛固定，用于制备石蜡标本。

1.5.2.1 血糖、血脂检测 小鼠取血后在4℃条件下3 000 r/min离心10 min，冰上分离血清，按试剂盒说明书采用葡萄糖氧化酶法检测FBG和糖耐量，糖耐量测试按0.2 mL/10 g剂量一次性给予小鼠腹腔注射10%葡萄糖溶液，于2 h后，取尾尖血测定血糖值；按生化试剂盒说明书测定血中GHbA1c、LDL、HDL、TG、TC含量。

1.5.2.2 胰岛素检测 采用ELISA法检测小鼠胰岛素水平，计算胰岛素抵抗指数(IRI)。IRI=(空腹胰岛素浓度×空腹血糖浓度)/22.5。

1.5.2.3 炎症因子和氧化应激指标的检测 采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-6、IL-1β，按试剂盒说明书分别以邻苯三酚自氧化法剂盒法、DTNB比色法和硫代巴比妥酸比色法测定血中SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

1.5.2.4 胰腺组织病理观察 取胰腺后，10%甲醛固定，洗涤、脱水、制成蜡块，切片，烘烤(60 ℃，1 h)，苏木素-伊红染色(HE)染色，封片，200 倍镜下光学显微镜观察。

1.6 统计学方法 所有数据通过SPSS19.0软件处理，数据采用均数±标准差表示，采用单因素方差分析(ANOVA)判断总体显著性差异，组间资料采用LSD检验分析统计学差异，以P<0.05认为差异显著。

2 结果

2.1 复方消渴乳膏对糖尿病小鼠体质量的影响 各组小鼠从第1～17 周体质量变化情况如图1所示，每组小鼠体质量总体呈增长趋势。造模成功3周后即是从第10～17周各组小鼠体质量变化差别明显，其中与正常组比较，模型组小鼠的体质量从第10～17 周升高趋势显著(P<0.001)。与模型组比较，二甲双胍组小鼠体质量从第11～17周较模型组体质量降低(P<0.05，P<0.001)；乳膏组小鼠体质量从第12周开始较模型组体质量降低(P<0.05)，第13～15周降低明显(P<0.01)，第16周后，体质量显著降低(P<0.001)。实验结果表明，复方消渴乳膏可以减轻小鼠食用高脂饲料诱导的体质量增加的现象。

图1 各组小鼠第1～17 周体质量变化比较

2.2 复方消渴乳膏对糖尿病小鼠FBG和OGTT的影响 见图2。

图2 各组小鼠第1～17 周FBG、OGTT变化比较

与正常组比较，模型组小鼠的FBG从第10～17 周显著升高(P<0.001)，OGTT从第10～17周显著升高(P<0.001)。与模型组对比，乳膏组FBG在第12周时较模型组明显降低(P<0.01)，第13～17周降低显著(P<0.001)；乳膏组OGTT在第10周时较模型组显著降低(P<0.001)。与模型组对比，二甲双胍组FBG在第10周时较模型组明显降低(P<0.01)，第11周后较模型组显著降低(P<0.001)；OGTT从第10周开始降低显著(P<0.05)，第12周后较模型组显著降低(P<0.001)。结果表明，复方消渴乳膏可以显著降低FBG与OGTT。

2.3 复方消渴乳膏对糖尿病小鼠GHbA1c、胰岛素(INS)和胰岛素抵抗指数(IRI)的影响 见表1。

表1 各组小鼠GHbA1c、INS、IRI比较

2.4 复方消渴乳膏对糖尿病小鼠血脂的影响 见表2。

表2 各组小鼠血脂水平比较

2.5 复方消渴乳膏对糖尿病小鼠炎症相关因子的影响 见表3。

表3 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较

2.6 复方消渴乳膏对糖尿病小鼠氧化应激指标的影响 见表4。

表4 各组小鼠血SOD、GPX活性和MDA含量比较

2.7 复方消渴乳膏对糖尿病小鼠胰腺组织病理变化的影响 正常组胰岛形状规则，呈圆形或椭圆形团索状，边界清晰，中央胰岛β细胞分布均匀，排列紧密，胞浆丰富。模型组胰岛萎缩，边缘不整，中央胰岛β细胞稀疏；乳膏组和二甲双胍组与模型组比较，胰岛边界逐渐清晰。见图3。

图3 各组小鼠胰腺组织病理变化(HE，×200，↓：胰岛)

3 讨论

糖尿病属于中医学“消渴”范畴，基本病机为阴津亏损、燥热偏胜，血瘀痰湿之标贯穿其中，治疗应针对病机，扶正祛邪。本课题组以《仁斋直指方》之玉泉丸为基础方药，在此基础上加减配制成复方消渴乳膏，组方为葛根、天花粉、玄参、生地黄、苍术、桑叶、姜黄。本方宗消渴病以阴津亏虚为本，痰瘀燥热为标之病机，立滋阴润燥，和血通脉之法。方中葛根生津止渴、解肌退热、起阴气、主消渴为君药。天花粉清热泻火而退五脏郁热，生津止渴而润五脏之燥；生地黄滋阴清热、生津止渴、养血润燥，两者共为臣药。玄参甘苦咸寒，寒而不峻，润而不腻，上清肺热，下滋肾阴，中消胃燥；苍术健脾燥湿，解郁辟秽，气味辛烈，强胃健脾，发谷之气；两者共为佐药。桑叶苦甘性寒，向外疏风散热，向内清肺润燥；姜黄苦辛性温，善行气和血，通经活络，内入脏腑，外彻皮毛；两者发表透皮，外引内透，直达病所，共为使药。全方众药配合，共奏养阴生津、止渴除烦、和血通脉、化痰调中之功效，适用于消渴病之上中下三消及气血周流不畅诸证。

口服降糖药药理机制明确，降糖效果明显，多数患者一经确诊，口服即可降糖。然而，糖尿病是涉及全身的代谢性疾病，使用单一的口服降糖西药很难取得长久而理想的疗效。一方面，糖尿病患者体质各异，对某类或某几类降糖药物不敏感或因为药物不良反应不能耐受，另一方面，糖尿病属慢性进展性疾病，随着病程的延长，病情逐渐加重，血糖有逐渐升高的趋势，血糖控制难度逐渐增大，使用单一降糖药物很难获得理想的血糖控制效果，所以近年糖尿病及其并发症的治疗多用复方制剂。中药具有毒副作用小、作用温和而持久的特点，擅长多靶点的综合性调理并延缓并发症的发展。复方消渴乳膏经皮给药可以避免胃肠道对药物的降解，延长给药间隔，减少给药次数，降低药物毒副作用，维持恒定血药浓度和药理效应[2]。若与降糖西药联合，更符合糖尿病的病机特点和防治要求。

实验结果可见：应用复方消渴乳膏12周后，高脂饲养联合STZ诱导糖尿病小鼠体质量与模型组小鼠比较有显著性的差异，复方消渴乳膏可以降低糖尿病小鼠空腹血糖、口服葡萄糖耐量试验、糖基化血红蛋白，提高胰岛素、降低胰岛素抵抗指数，改善胰腺病理改变，从而调节糖尿病引起的糖代谢紊乱。血脂检测显示复方消渴乳膏降低糖尿病小鼠TC、TG的水平；证明复方消渴乳膏可以调节脂代谢、调节糖尿病小鼠的脂代谢紊乱。

氧化应激被认为是糖尿病及其并发症发展重要危险因素。胰岛素不足和高血糖通过ROS介导的脂质过氧化进一步增加对糖尿病的损伤。MDA是脂质过氧化过程的最终产物，对DNA和蛋白质都有毒性作用，在氧化应激条件下血液和器官中MDA水平升高。很多的研究表明，STZ诱导的糖尿病大鼠或小鼠体内SOD、GSH-Px活性降低，MDA水平增高[3]。本研究中，高脂饲养联合STZ诱导糖尿病小鼠表现为SOD和GSH-P活性降低，MDA含量升高；复方消渴乳膏组小鼠GPX与SOD活性提高，证明复方消渴乳膏可以对抗高脂饲养联合STZ的糖尿病小鼠的氧化应激反应。

胰岛素抵抗(IR)是指胰岛素对其靶组织的效应降低，IR与激活NF-κB通路产生炎症有关，而高血糖又可以引起血管内皮细胞IR，形成恶性循环[4]。同时IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子可以诱发IR，其水平愈高则发生糖尿病并发症的几率越大，患者病情越严重[5]。IL-1β是单核细胞表达的重要免疫调节剂，可对胰岛β细胞产生毒性[6]。1型糖尿病临床试验提示IL-1β抑制可诱导胰腺β细胞的保存[7-8]。本实验结果显示，复方消渴乳膏组小鼠相较于糖尿病组小鼠IRI下降，IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子较糖尿病模型组小鼠也降低，可以看出复方消渴乳膏有降低IRI，抑制IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子改善胰岛素抵抗的作用。

综上所述，复方消渴乳膏能防治高脂饲养联合STZ诱导糖尿病小鼠的糖脂毒性、炎症反应和氧化应激，对防治糖尿病有一定疗效。