石墨烯增敏的SPR 技术应用于HIV1 p24 抗原的检测

彭芳，张良，何建安*

（1.广州市荔湾区疾病预防控制中心，广东广州 510500；2.深圳市检验检疫科学研究院，广东深圳 518045）

早发现、早诊断是目前防控艾滋病病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）感染者/AIDS（Acquired Immune Deficiency Syndrome)病人传播的最有效途径之一[1]。目前，HIV 的检测方法主要有核酸检测、抗体和抗原检测，核酸检测虽然灵敏度高但存在仪器昂贵、操作要求高等不足，不易在基层普及[2-4]；而抗体检测通常是在感染3 周至2 个月后才能被检测出来。HIV 感染人体后，感染者血液中最先出现的是P24 抗原，P24 抗原含量低[5]，目前常用酶联免疫方法（ELISA）检测，该法存在法操作繁琐、需要体积较大（20～200 μL）、孵育时间较长等不足，不适用于大批量快速检测[6]。

表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）生物传感器是最常用的光学生物传感技术，由于能够在无需标记的情况下对生物分子的相互作用进行实时测量，已成为研究生物分子相互作用动力学性质的有力工具之一[7]。目前，SPR 生物传感器已广泛应用于疾病诊断、环境监测以及食品安全等方面[8]。此外，多通道的SPR 生物传感器可以同时实现监控生物分子间相互作用和定量生物标志物。一直以来，大量的科研工作者致力于研究用纳米粒子，如金纳米粒子、磁性纳米粒子以及碳管等用于增强SPR生物传感器的检测灵敏度[9-10]。氧化石墨烯（GO）具有生物相容性良好、比表面积大、对生物分子的负载能力强以及电学性质优异等优势而成为扩大生物传感器信号的理想材料[11]。目前，石墨烯联合SPRi 生物传染器在蛋白质检测中有广泛应用，如检测血清中二聚体[12]、胎牛血清[13]、鼠IgG[14]。研究结果均表明，基于石墨烯的表面等离子体共振传感器在高灵敏度检测蛋白质方面具有非常好的应用前景。本研究探索石墨烯增敏的表面等离子共振技术对HIV1 p24 抗原进行检测，有望对HIV 感染者进行早期快速鉴定，对艾滋病的防控具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

SPR imager @Ⅱ型SPR 分析仪，美国GWC 公司；SPR 检测芯片，广州高通。活化液1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺（EDC）/N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、封闭液乙醇胺、再生液甘氨酸、人IgG、艾滋单抗，杭州启泰生物；重组HIV1 p-24 蛋白，abcam；非特异性溶菌酶、人血清白蛋白，欣海凌生物；PDGF BB，百胜科创生物；PSA，上海羽朵生物；等离子清洗仪。

1.2 芯片的制备

（1）芯片的表面改性：芯片经过去离子蒸馏水、95%乙醇的清洗后再用等离子清洗仪清洗5 min；（2）芯片的活化：用1 mmol/L 的PEC 浸泡芯片活化5 h，芯片水洗冲干后立即浸泡于现配1 mg/mL 的石墨烯溶液中5 h；（3）抗体点样：用乙酸-乙酸钠（0.2 mmol/L，pH 4.5）与甘油配制成10%的甘油点样液，将艾滋单抗、人IgG 用点样液作5 倍稀释处理后，取0.5 μL 混合液点样于芯片表面位置，室温固定2 h；（4）芯片表面封闭：将点样好的SPR 芯片固定并安装在SPR 分析仪上，用PBS 液调试最佳共振角（70°～100°），基线平稳后，用封闭液乙醇胺处理封闭芯片未反应的活化表面，完成后用再生液处理，去除物理吸附的物质和封闭液，然后可上样检测。

参考根据Hummers[15]方法，合成石墨烯，构建金-石墨烯增敏的表面SPR 技术。

1.3 检测条件优化

1.3.1 HIV1 p24 抗体浓度的选择

用PBS 缓冲液稀释HIV1 p24 抗体，分别配置成浓度为200 μg/mL、150 μg/mL、125 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL，点样芯片后检测SPR 信号，找到最佳HIV1 p24 抗体点样浓度。

1.3.2 芯片再生能力检测

用制备好的石墨烯增敏的SPR 芯片检测HIV1 p24 抗原，观测信号变化幅度，再用甘氨酸处理芯片后，检测其再生能力。

1.3.3 芯片检测HIV1 p24 抗原的重复性

在芯片上点样特异性HIV1 p24 抗体4 个检测点与1 个空白对照点，将浓度为1 μg/mL 的HIV1 p24抗原进样，分3 批芯片重复检测3 次。

1.3.4 芯片灵敏性和特异性检测

在P24 抗体的最佳固定浓度下，分别检测1 000 ng/mL、500 ng/mL、100 ng/mL 和50 ng/mL、10 ng/mL 的HIV1 p24 抗原。同时，同条件下用未经石墨烯增敏的SPR 芯片检测浓度为1 000 ng/mL、500 ng/mL、250 ng/mL 和125 ng/mL、63 ng/mL 的HIV1 p24 抗原。在同一张芯片上点上特异性的HIV1 p24 抗体和非特异性溶菌酶、人血清白蛋白、PDGF BB、PSA、人 IgG 作为对照点，在SPR 仪上检测HIV1 p24 抗原，测定芯片特异性。

1.3.5 样品的检测

将HIV1 p24 抗原分别加入阴性对照血清中模拟真实样品，由于血清样品非特异性吸附较大，稀释10 倍血清，制备成浓度为1 000 ng/mL、500 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL 和10 ng/mL 的样品，测定在实际样品中的检测情况。

2 结果与分析

2.1 HIV1 p24 抗体点样浓度的选择

如图1 所示，随着点样浓度的降低，待检测分析物（P24 抗原）信号值降低；稀释至100 μg/mL 后，抗体信号趋向饱和，点样物的浓度对检测信号影响不明显，信号较稳定。

图1 HIV1 p24 抗体浓度

2.2 芯片再生能力检测

如图2 所示，在SPR 芯片上将试剂P24 抗体点样于不同位置后，进行不同浓度的P24 抗原上机，用pH=2.0 的甘氨酸作为SPR 芯片再生试剂重复检测5次，每次检测信号均可回到基线位置，表明该再生试剂具有良好的再生效果。

图2 芯片的再生能力

2.3 SPR 技术检测HIV1 p24 抗原的重复性

图3 结果显示，3 批芯片检测的信号反应强度接近，强度差异不大于5%。

图3 检测HIV1 p24 抗原的重复性

2.4 检测HIV1 p24 抗原的灵敏度和特异性

HIV1 p24 抗原为10 ng/mL 仍有较强检测信号，由Igor 分析软件处理，去除空白对照值后作图，对应的强度值如图4a 所示，随着抗原浓度的增高，信号强度也随之增加；同时，图4b 显示同条件下用未经石墨烯增敏的SPR 芯片检测一系列HIV1 p24 抗原，HIV1 p24 抗原为125 ng/mL 时仍有较强检测信号，浓度为63 ng/mL 时基本无检测信号，说明经过石墨烯增敏的SPR 芯片检测灵敏度提高。图5 特性性结果显示，HIV1 p24 抗体点样点有特异性信号出现，而对照样品溶菌酶、人血清白蛋白、PDGF BB、PSA、人IgG 探针点没有明显的信号变化。表明石墨烯增敏的SPR 技术能特异性地检测HIV1 p24。

2.5 检测样品中HIV1 p24 抗原浓度

图6 结果显示：当实际样品中HIV1 p24 抗原浓度为10 ng/mL 时仍能检出，但由于存在非特异性吸附，模拟真实样品通常产生的背景信号比HIV1 p24抗原在缓冲液中的高，检测灵敏度下降。

3 结论

本研究采用聚乙二醇高分子处理的特异性吸附表面，将石墨烯通过静电作用连接在SPR 芯片表面，HIV1 p24 特异性抗体通过石墨烯表面的羧基官能团共价结合作用固定在芯片的表面，建立一种无标记、快速的基于石墨烯增敏的表面等离子共振技术用于检测HIV1 p24 抗原。该芯片具有很好的特异性和灵敏度，最低检出限为10 ng/mL，相较于相同条件传统Au-SPR 生物传感器检测得到的最低检测限（63 ng/mL），至少降低了6 倍。当实际血清样品中HIV1 p24 浓度为10 ng/mL 时仍能检出，但由于存在非特异性吸附，背景值增加，检测信号有所下降。

图4 SPR 芯片检测HIV1 p24 灵敏度

图5 检测特异性

图6 检测实际样品的灵敏度

本研究样品用量少、检测时间短、高通量且无标记、能实现在线样品检测、步骤简单，SPR 技术应用成熟以后，可以运用全自动点样机，一张微小型芯片将可检测几十个样本，同时能再生处理实现多次重复使用，检测分析的经济成本将更低、批量检测的速度更快，对于大批量筛查工作更加有利。基于以上优点，石墨烯增敏的SPR 芯片技术有望为HIV 感染者的早期筛查提供一个有力的技术平台。