在角质细胞和EpiSkin 表皮模型上测试化妆品原料对CD44 蛋白表达的影响

周明，王萍，朱炎，裘捷，丁春梅，王伟

（1.复旦大学生命科学学院，上海 200433；2.欧莱雅研发与创新中心，上海 201206）

皮肤的保湿作用是皮肤屏障功效中一个重要的指标。透明质酸（Hyaluronan，HA）又称玻尿酸，是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位玻尿酸，分子能携带500 倍以上的水分，是当今公认的最佳保湿成分，被广泛应用于保养品和化妆品中[1-3]。最新的研究证实，HA 在成纤维细胞及表皮的角质形成细胞中均能产生，存在于大多数皮肤细胞的分解合成代谢动态中[1-3]。在成纤维细胞和角质形成细胞中，HA 在细胞胞外基质与主要细胞表面的锚定受体CD44 蛋白相互作用，在控制细胞生理过程中发挥调节作用，介导细胞内信号直接或间接地通过CD44与细胞骨架、EGF（表皮细胞生长因子）和TGF（转化生长因子）受体等进行交互作用[4-5]。本研究旨在二维角质细胞和三维EpiSkin 表皮模型上测试化妆品原料对CD44 蛋白表达的影响，比较两个系统表达的差异。

1 材料与方法

1.1 试验材料

人原代角质形成细胞是从正常人包皮环切术的医疗废弃样品中分离获取；EpiSkin 表皮模型由斯安肤诺（上海）有限公司生产。测试的化妆品原料及浓度如表1 所示。

1.2 试剂与仪器

4% 组织细胞固定液，Solarbio P1110；DAPI，Invitrogen D1306；24 孔细胞爬片，晶安生物；大鼠抗CD44 抗体，Merck 217594；驴抗大鼠IgG 荧光标记二抗，Invitrogen A21208。

KS-18 超净工作台，ThermoFisher；240i 二氧化碳培养箱，HERAcell；DMI3000B 倒置相差显微镜，Leica；Ti-S 荧光显微镜，NIKON；Countess Ⅱ细胞计数仪，美国Invitrogen；XP205/XS2002S 电子天平，METTLER TOLEDO；BCD-241WDBB 冷藏冰箱，海尔；MDF-U73V 超低温冰箱，SANYO；CY50925-70液氮罐，Thermo-Fisher；SILVER 水浴锅，LAUDA ECO；Sorvall ST16R 离心机，Thermo-Fisher。

1.3 实验方法

1.3.1 2D 人角质细胞的培养

如图1 所示，在48 h 的图片视野中主要观察到的是3t3 饲养层细胞。人角质细胞在培养6 d 后融合率在70%～80%左右时用胰酶消化收获细胞。

图1 角质细胞在接种不同时间后的细胞形态

1.3.2 2D 人角质细胞的培养及原料处理

人角质细胞在含10% FBS（Gibco）的DMEM/F12（3 ∶1）（Gibco）培养基中培养6 d 后，接种至放置了细胞爬片（晶安生物）的24 孔板中。细胞样品按处理分组，加入相应原料浓度（表2）的培养基培养48 h。

1.3.3 3D EpiSkin 人表皮模型的培养及原料处理

人角质细胞通过扩增后接种于胶原基质的插件上，液-液培养3 d 后，用分化培养基进行4 d 的气-液培养。在模型培养7 d 后，模型按处理分组，加入相应原料浓度的培养基培养48 h。各分组如表3所示。

表1 测试的原料及浓度

表2 二维测试体系分组处理

表3 三维测试体系分组处理

1.3.4 人角质细胞CD44 蛋白荧光染色

人角质细胞样品培养48 h 后用4%多聚甲醛固定，然后用5%的驴血清封闭，再加入抗CD44 蛋白的抗体（Abcam）4 ℃孵育过夜。第2 d 用AF488 标记的二抗（Invitrogen）室温孵育后，用DAPI（Dako）对细胞核染色，用抗荧光焠灭剂（Dako）封片。

1.3.5 EpiSkin 人表皮模型CD44 蛋白荧光染色

表皮模型样品在37 ℃培养箱中培养48 h 后收样，进行10 μm 冷冻切片（LEICA），用0.2%的BSA封闭1 h，用抗CD44 蛋白抗体（Abcam）室温孵育1 h 后用AF488 标记的二抗（Invitrogen）室温孵育1 h，最后用DAPI（Dako）对细胞核染色，用抗荧光焠灭剂（Dako）封片。

1.3.6 图像和数据处理

通过荧光显微镜对荧光染色切片样品进行观察，每个样品随机选取5 个区域拍照。用ImageJ 软件（1.48 V）对拍摄的图片进行定量分析统计。每个处理组的数据值（累积光密度IOD）与相应对照组的IOD 进行比较得出相对IOD 值，误差条标示每个处理组的标准方差，采用双尾t检验。

2 结果与分析

2.1 CD44 蛋白在人角质细胞上的表达

如图2 和图3 所示，相比于对照组，ProVB5和HA 单独处理组和联合配伍组的二维细胞系统中CD44 蛋白表达都有显著增加。

图2 CD44 蛋白在人角质细胞上的表达（荧光照片）

2.2 CD44 蛋白在EpiSkin 人表皮模型上的表达

如图4 和图5 所示，各处理组相比对照组，CD44 蛋白表达未见显著增加，但观察到RA 处理组相比DMSO 对照组模型厚度有显著增厚。

图3 CD44 蛋白在人角质细胞上的表达

图4 CD44 蛋白在EpiSkin 人表皮模型上的表达（荧光照片）

图5 CD44 蛋白在EpiSkin 人表皮模型上的表达及EpiSkin 模型细胞层厚度

HA 是细胞外基质的主要成分，在皮肤组织尤其是表皮中含量丰富。CD44 蛋白是一个普遍存在、数量丰富、功能重要的细胞表面受体家族，同时也是HA 的锚定结合受体[8-9]。从图2 和图5a 可以看出，CD44 蛋白普遍表达于角质细胞表面和EpiSkin 模型基底层、棘层，角质层存在一定非特异性吸附作用，使得荧光信息也出现在角质层。

有报道在离体人皮肤和小鼠上进行了HA 对CD44 表达影响的实验[10-11]，但在EpiSkin 模型上CD44 蛋白的表达情况未见有相关研究和报道。本研究从皮肤模型的角度考察了在不同化妆品原料的共培养下，CD44 蛋白在EpiSkin 模型上的表达情况。在角质形成细胞的二维模型上，可以观察到单独的ProVB5 和HA 组或者两者的配伍组对CD44 蛋白的表达都有显著的增强作用（图3），但这种增强效果在EpiSkin 模型上并未观察到（图5a）。与三维皮肤模型中的角质形成细胞相比，二维培养的角质形成细胞存在以下2 点区别：（1）形态上不具备角质形成细胞分化后形成的基底层、棘层颗粒层角质层等分层结构；（2）不具备角质形成细胞分化后胞内的生化代谢酶体系。因此，CD44 蛋白在二维和三维体系中的表达存在很大的差异，这也是三维皮肤模型用来研究人体皮肤具有的优势之一[12]。

在EpiSkin 模型上虽然没有观察到CD44 表达的显著变化，但发现RA 处理组对皮肤模型在厚度的影响上有显著差异（图5b）。有相关研究表明，RA 对角质形成细胞增殖分化具有很强的作用[13]。从本研究结果看，RA 对皮肤模型中的角质形成细胞基底层具有强烈的增殖作用，造成皮肤模型分化不全（缺少颗粒层）。该现象提醒今后的研究需要注意RA 极强的增殖作用造成分化不全的特点。RA 对表皮模型的显著增厚作用源于RA 对细胞具有很强的增殖分化作用，该作用可以使其在活性化妆品原料对皮肤的增殖分化研究中作为一种参照。

基于EpiSkin 表皮模型技术开发的中国人角质形成细胞表皮重建模型已于2015 年起商用。该表皮模型形态和微观结构、分化标记、屏障功能以及批次的稳定性和重复性都通过了验证。EpiSkin 表皮模型是一种成熟的商业化产品，用于模拟人体表皮的科学研究和对化妆品原材料和成品的安全性评估都是强有力的工具[6-7]。本研究首次选用EpiSkin 表皮模型来测试化妆品原材料对CD44 蛋白表达的影响，这也是对EpiSkin 表皮模型应用领域的一次探索性研究。

3 结论

与二维模型相比，三维表皮模型用于人体皮肤研究更具有优势。视黄酸对表皮模型。后续的研究可以采用其他皮肤模型再次验证，可以作为开发皮肤模型评估增殖愈合相关的功效的研究方向。

在人角质细胞测试中，ProVB5、HA 单独处理组和联合配伍组的CD44 蛋白表达均有显著增加，但这种现象未在表皮模型中观察到，因此CD44 蛋白在二维和三维体系中的表达存在差异；RA 对表皮模型的显著增厚作用源于RA 对细胞具有很强的增殖分化作用，该作用可以使其在活性化妆品原料对皮肤的增殖分化研究中作为一种参照。