具有高溶栓活性的淡豆豉制备工艺优化及成分分析

李俊健，黄剑钊，林锦铭，高杰贤，黎攀，杜冰

(华南农业大学 食品学院，广州 510642)

淡豆豉(sojae semen praeparatum)是以豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的成熟种子为主料，以青蒿、桑叶为辅料，经发酵加工而成的中药，药食同源，在中医临床上被用于治疗寒热头痛、烦躁胸闷等症状[1]；现代科学研究表明，发酵大豆具有抗氧化、提高免疫力及抗疲劳等功效[2-4]。目前国内外对淡豆豉的研究多集中于其酶活、异黄酮及风味上[5-7]，研究表明，曲霉、枯草芽孢杆菌等发酵可提升淡豆豉中纤溶酶、蛋白酶和β-葡萄糖苷酶的活性[8]；豆豉异黄酮已被证实具有较强的抗氧化损伤、抗癌等功效[9]；利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME/GC-MS)结合电子感官对淡豆豉发酵过程中的风味进行分析也是研究的一大热点[10]。

血栓是心肌梗死、脑梗塞等致死性心血管疾病的共同发病机制，对人类健康危害极大[11-12]。从日本纳豆中提取的纳豆激酶是目前研究较多的新一代溶栓剂，其研究已经达到分子水平[13]，我国传统中药淡豆豉的发酵工艺与日本纳豆类似，研究人员发现淡豆豉中也存在着溶栓酶[14]，该酶可以溶解血栓且溶栓效率比药物还要高。但日本纳豆以其独特的风味和高溶栓酶活力早已风靡全球，淡豆豉的开发研究仍停滞在普通食品阶段[15]，究其原因是中国淡豆豉在发酵过程中沿袭传统的自然发酵模式，没有进行大规模的纯种发酵研究，导致产品质量不一，食品的安全性难以保证[16-17]。为解决发酵豆豉、豆酱等豆制品风味不佳的问题，使用多菌种复合发酵的方法被提出，结果表明霉菌、乳酸菌等菌种复合发酵不仅可以使豆制品的感官可接受度升高，还能提高其功能成分含量，成为提升豆制品品质的重要方法[18-21]。

本研究是在课题组前期已确定中国根霉12能被应用于淡豆豉的发酵并具有产高活性溶栓酶的基础上[22-23]，把中国根霉12与乳酸芽孢杆菌DU-106、毕赤酵母搭配进行复合发酵，通过优化发酵工艺开发出具有高溶栓酶活力的淡豆豉，并与市售的传统工艺淡豆豉进行成分对比，研究结果有利于为复合发酵制作高溶栓酶活力淡豆豉提供参考。

1 材料与设备

黑豆：天地粮人有限公司；市售淡豆豉、桑叶、青蒿：均购于广州南北行中药饮片有限公司；纤维蛋白原(Sigma F-8630)、凝血酶(Sigma T-4648)：购于Sigma公司；尿激酶标准品(1240 IU/瓶)、芦丁、染料木素、大豆苷元等标准对照品：购于中国药品生物制品检定所；乳酸芽孢杆菌DU-106：筛选于传统发酵奶酪，菌粉浓度为1012CFU/g；中国根霉(Rhizopuschinesis)12、乳酸芽孢杆菌DU-106、毕赤酵母：均由华南农业大学新资源与功能性原料研究及评价中心鉴定及保藏；其他无机试剂均为分析纯。

RXZ型人工气候培养箱 宁波江南仪器厂；DDC06TSL型低温热泵干燥箱、752-N型紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；SKD-3000型全自动凯氏定氮仪 上海沛欧分析仪器有限公司；Agilent 1100高效液相色谱仪 安捷伦有限公司。

2 实验方法

2.1 发酵菌种的活化及扩大培养

取中国根霉12和毕赤酵母保藏菌种1～2环，接种到PDA斜面培养基中，分别于恒温培养箱中于32 ℃和28 ℃培养48 h后，接种培养好的菌种到扩大培养马铃薯葡萄糖液体培养基中，分别于32 ℃和28 ℃培养48 h，制得中国根霉12和酵母发酵种子液，备用。称取0.1 g的乳酸芽孢杆菌DU-106菌粉加入到100 mL乳酸菌增殖液体培养基中，于37 ℃培养12 h，制得乳酸芽孢杆菌DU-106种子液备用。

2.2 淡豆豉的制备工艺

黑豆→挑选→浸泡→蒸煮→冷却→接种→发酵→干燥→成品。

挑选成熟、颗粒均匀饱满、无腐烂虫蛀的黑豆为原料；按《中国药典》中淡豆豉炮制工艺进行浸泡，取桑叶90 g、青蒿100 g，加入水煎煮3 次后拌入1000 g黑豆浸泡12 h；将拌有药汁浸泡预处理后的大豆隔水蒸煮一段时间，在一定发酵温度下接入复合菌种：中国根霉12(接种量为15%，V/W)、乳酸芽孢杆菌DU-106(接种量为107CFU/g)和毕赤酵母(接种量为1%，V/W)发酵一定时间，40 ℃低温热泵干燥至水分≤8.0%后得到淡豆豉。

2.3 淡豆豉发酵工艺的优化

2.3.1 黑豆蒸煮时间对淡豆豉溶栓酶活性的影响

将药汁浸泡后的大豆分别隔水蒸0.5，1，1.5，2，2.5 h，冷却后接入复合菌种在32 ℃下发酵7 d，测定溶栓酶活性，优化蒸煮时间。

2.3.2 发酵时间对淡豆豉溶栓酶活性的影响

以实验得到的蒸煮时间，在32 ℃恒温培养箱下，探究不同发酵时间5，7，9，11 d下淡豆豉饮片的溶栓酶活性，优化淡豆豉的发酵时间。

2.3.3 发酵温度对淡豆豉溶栓酶活性的影响

以实验得到的最优蒸煮时间和最优发酵时间，探究不同发酵温度24，28，32，36，40 ℃下淡豆豉饮片的溶栓酶活性，优化淡豆豉的发酵温度。

2.4 淡豆豉溶栓酶活性的测定

2.4.1 牛纤维蛋白平板的制作

取25 mg牛纤维蛋白溶于10 mL PBS(pH 7.4)溶液中，现配现用；将平板置于水平桌面上，向平板中加入12 μL 100 U/mL的凝血酶溶液，再加入5 mL牛纤维蛋白溶液，轻轻转动平板使两种溶液混匀，混匀后加入5 mL 1.5%的琼脂糖溶液，继续转动直至平板凝固，在室温下静置4 h以上，打孔进样。

2.4.2 溶栓酶活性的测定

以尿激酶的活力单位表示溶栓酶活性；取尿激酶溶于PBS中制得100 μL浓度为1240 IU/mL的尿激酶溶液并按梯度稀释，取10 μL系列尿激酶标准溶液打入到平板的圆孔内，在37 ℃培养18 h后，测量水溶圈的垂直直径并绘制标准曲线。

取0.05 g样品放入离心管中，加入1.5 mL PBS溶液使其充分溶解，在4 ℃冰箱中放置24 h后取出并摇匀，10000 r/min离心10 min，取上清液备用。吸取10 μL样品溶液打入到平板的圆孔内，37 ℃培养18 h后，测量水溶圈的垂直直径。将样品水溶圈的垂直直径乘积代入尿激酶标准曲线，得到每毫升样品溶液的溶栓酶活性，再根据所配样品溶液的浓度进行换算成每克样品溶液的溶栓酶活性。

2.5 淡豆豉的品质评价

蛋白质按照GB 5009.5-2016凯氏定氮法测定[24]；氨基酸态氮按照GB 5009.235-2016酸度计法测定[25]；总黄酮按照陈怡等[26]的超声辅助法结合硝酸钠-硝酸铝比色法测定；大豆异黄酮按照GB/T 23788-2009中描述的方法进行测定[27]；还原糖按照GB 5009.7-2016直接滴定法测定[28]；黄曲霉毒素B1按照GB 5009.22-2016同位素稀释液相色谱-串联质谱法测定[29]。

3 结果与分析

3.1 不同蒸煮时间对淡豆豉溶栓酶活力的影响

以溶解圈面积为横坐标，溶栓酶活力单位对数为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线为：y=0.4809x+0.538，R2=0.9971，该标准曲线可信。

图1 不同蒸煮时间对淡豆豉溶栓酶活力的影响Fig.1 Effect of different cooking time on thrombolytic enzyme activity of SSP

由图1可知，在其他工艺参数相同的情况下，不同的蒸煮时间对淡豆豉的溶栓酶活性具有显著影响，随着蒸煮时间的增加，溶栓酶活性增加，蒸煮2 h的溶栓酶活性最高，达到8165.43 IU/g，进一步延长蒸煮时间，对溶栓酶活性无增加影响，后续实验中黑豆均蒸煮2 h。

3.2 不同发酵时间对淡豆豉溶栓酶活力的影响

以溶解圈面积为横坐标，溶栓酶活力单位对数为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线为：y=0.4456x+1.3394，R2=0.9963，该标准曲线可信。

图2 不同发酵时间对淡豆豉溶栓酶活力的影响Fig.2 Effect of different fermentation time on thrombolytic enzyme activity of SSP

由图2可知，在黑豆蒸煮2 h，发酵温度相同的情况下，不同的发酵时间对淡豆豉溶栓酶活性具有显著影响，发酵7 d时溶栓酶活性最高，达到7152 IU/g，随着发酵时间的增加，溶栓酶活性下降，后续实验均发酵7 d。

3.3 不同发酵温度对淡豆豉溶栓酶活力的影响

以溶解圈面积为横坐标，溶栓酶活力单位对数为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线为：y=0.4934x+0.4709，R2=0.9952，该标准曲线可信。

图3 不同发酵温度对淡豆豉溶栓酶活力的影响Fig.3 Effect of different fermentation temperatures on thrombolytic enzyme activity of SSP

由图3可知，在黑豆蒸煮2 h、发酵7 d的情况下，不同的发酵温度对淡豆豉溶栓酶活性具有显著影响，28 ℃发酵的淡豆豉溶栓酶活性最高，达到15530.98 IU/g，之后随着温度的升高，淡豆豉溶栓酶活力下降。发酵温度过高不利于发酵菌种的生长及溶栓酶的产生，故发酵温度选定为28 ℃。

淡豆豉的最优制备工艺为黑豆蒸煮2 h，在28 ℃下发酵7 d，后续实验中发酵淡豆豉均使用此制备工艺。

3.4 最优工艺淡豆豉的评价及对比

3.4.1 不同淡豆豉样品的理化指标对比

表1 不同淡豆豉样品的理化指标测定Table 1 Determination of physicochemical indexes of various SSP samples

由表1可知，复合发酵得到的淡豆豉蛋白质含量与市售淡豆豉蛋白质含量相当，蛋白质含量分别为45.5，45.6 g/100 g。在豆豉发酵过程中，氨基酸态氮含量的变化可用来判断产品蛋白质的水解程度，复合发酵得到的淡豆豉氨基酸态氮含量比市售淡豆豉的氨基酸态氮含量略少，发酵淡豆豉的氨基酸态氮含量为0.59 g/100 g，市售淡豆豉的氨基酸态氮含量为0.86 g/100 g。复合发酵淡豆豉的总黄酮含量比市售淡豆豉略低，发酵淡豆豉总黄酮含量为20.0 mg/100 g,市售淡豆豉总黄酮含量为25.7 mg/100 g。

无论是复合发酵的淡豆豉，还是市售传统炮制工艺的淡豆豉，其还原糖含量都比较低，低于GB 5009.7-2016《食品安全国家标准》 食品中还原糖的测定中规定的检测下限，推测是在发酵过程中微生物利用了黑豆中的还原糖作为碳源。在发酵淡豆豉中也未检测到黄曲霉毒素B1，说明发酵得到的溶栓淡豆豉较为安全。

3.4.2 不同淡豆豉样品的异黄酮含量对比

图4 不同淡豆豉的异黄酮含量对比Fig.4 Comparison of isoflavone content in various kinds of SSP

由图4可知，复合发酵淡豆豉中大豆异黄酮的含量比市售淡豆豉的含量要高，发酵淡豆豉的大豆异黄酮含量为3.03 mg/g，而市售淡豆豉的大豆异黄酮含量为1.88 mg/g，上升了1.15 mg/g。其中相对于传统炮制工艺的市售淡豆豉，复合发酵可以明显提高异黄酮中大豆苷、染料木苷、大豆素、染料木素的含量，但对大豆黄苷、大豆黄素无明显影响。发酵淡豆豉的总异黄酮含量比市售淡豆豉高，其原因可能是发酵过程中微生物产生的β-葡萄糖苷酶等将黑豆中的糖苷型异黄酮转化成为苷元型异黄酮，游离异黄酮含量上升，异黄酮含量的上升有助于提高豆豉的生物活性[30]。

4 结论

本研究以黑豆为发酵基质，采用中国根霉12、乳酸芽孢杆菌DU-106、毕赤酵母复合发酵菌种制备具有高溶栓活性的淡豆豉，最佳的发酵工艺为黑豆先蒸煮2 h，在28 ℃条件下发酵7 d，此工艺下制得的淡豆豉溶栓酶活性可达(15530.98±1832.4)IU/g；与市售淡豆豉相比，最佳发酵工艺的淡豆豉蛋白质含量相当，氨基酸态氮与总黄酮含量略有下降，异黄酮中的大豆苷、染料木苷、大豆素、染料木素明显升高。应用复合发酵菌种经优化工艺发酵的淡豆豉溶栓活性高，异黄酮类物质含量升高明显；复合菌种发酵对提高淡豆豉的品质具有实际意义，可利用其继续开发具有高溶栓活性的淡豆豉产品。