梵净山茶生物活性成分及其抗氧化能力的分析

陆雨芳，刘庆庆，朱成成，段萧燕，赵高荣，平洪政，陈白洁，李刚凤

（铜仁学院，贵州 铜仁 554300）

梵净山茶以产于梵净山主脉及周边山峰支脉而得名，历史悠久，梵净山为唐朝时期八大茶区之一，拥有丰富茶叶资源，包含了绿茶、红茶、白茶、黑茶、乌龙茶等系列[1]。 梵净山茶的幼嫩芽叶、茶花、茶籽、茶根及茶梗中含有丰富的茶多酚、茶多糖、茶氨酸、儿茶素、黄酮、维生素C 等多种成分，具有降血糖、降血脂、抗氧化、延缓衰老、防治心血管疾病、防癌抗癌以及增强免疫力等功效， 能有效去除氧自由基和脂类自由基、预防脂质过氧化、增强抗氧化能力，是治疗疾病和保护人体健康的天然抗氧化剂。 同时，随着贵州加快发展特色优势产业的战略部署及梵净山品牌的提升，越来越多的人认识并喜欢上梵净山茶，在国家及政府大力支持下，贵州茶产业发展迅速，茶园面积连续两年居于全国茶园面积首位，在中国茶叶种植历史上创造出了“贵州奇迹”[2]。

茶叶中富含生物活性成分，大量学者对此进行了研究。 An 等[3]研究了黄茶在黄化过程中对茶叶中生物活性物质的影响；Pedan 等[4]研究了普洱茶中的生物活性成分的含量，并且通过主成分分析和系统聚类分析表明，研究生物活性成分可以很好地区分普洱茶的种类；Chai 等[5]研究了蓝莓叶茶在加工过程中抗氧化能力的变化，且进一步研究了酚类化合物、黄酮等物质对茶叶品质的影响；此外利用相关性分析来研究同等变量之间的相关性是一种经典的方法。 Wang 等[6]研究了铁观音乌龙茶提取物中的化学成分及其抗氧化活性，并利用相关性分析来研究多酚、黄酮等化合物与总抗氧化能力、DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率之间的相关性。 Fatanah 等[7]研究表明尾叶茶的抗氧化性（总抗氧化能力和DPPH）与总黄酮含量（total flavonoid content，TFC）和总酚含量（total phenolic content，TPC）之间有很强的相关性。 李丹等[8]研究了茶叶提取物中的生物活性成分与抗氧化活性的相关性。 韩延超等[9]研究了茶汤在贮藏期间的抗氧化活性物质与抗氧化性之间相关性以及茶汤色度与抗氧化性之间的相关性。 但有研究指出经典的相关性分析对于众多变量的分析会使表达的结果不完整、不充分、可解释性差，因此近年来普遍采用主成分分析和聚类分析的方法来弥补经典方法存在的不足[10]。

在国家政府对贵州传统文化及旅游产业的大力扶持下，梵净山茶逐渐走出国门，但有关梵净山茶的研究较少，因此，本文对5 种梵净山茶的生物活性成分及抗氧化能力进行研究及相关性分析，并对生物活性成分含量进行了主成分和聚类分析，以期提升梵净山系列茶品牌和质量鉴定水平，同时为梵净山茶今后抗氧化活性的评价提供更加便捷快速的途径，也为梵净山的综合开发和利用提供一定科学参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

藤茶：采购自梵净山内农户；苔茶、茗茶、小毛峰茶、金茯砖茶：贵州梵锦茶业有限公司。

没食子酸（标准品）、芦丁（标准品）：上海金穗生物科技有限公司；葡萄糖、无水乙醇（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；硫酸、苯酚（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；福林酚（生物试剂）：南京奥多福尼生物科技有限公司； 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer，PBS）：北京索莱宝科技有限以司；2，6-二氯靛酚（≥97.0%）：南京森贝伽生物科技有限公司；抗坏血酸（≥99.7%）：国药集团化学试剂有限公司；二苯基苦味酰基苯肼（DPPH）：美国Sigma 公司；邻二氮菲（分析纯）：广东汕头市西陇化工厂。

1.1.2 仪器与设备

721 型可见分光光度计： 上海舜守恒平科学仪器有限公司；DHG-907OA 电热鼓风干燥箱：常州普天仪器制造有限公司；HH-6 数显恒温水浴锅： 常州直播仪器有限公司；XH-C 旋涡混合器：金坛市城东新瑞仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

5 种梵净山茶经40 ℃干燥箱热风干燥2 h， 取出冷却至室温（25 ℃），组织破碎，过80 目筛，样品密封储藏待用。

1.2.2 生物活性成分含量及抗氧化能力的测定

1.2.2.1 梵净山茶中茶多酚含量的测定

精确称取5 种梵净山茶粉末各2.5g， 按1∶20（g/mL）加入蒸馏水，85 ℃浸提10 min，残渣重复浸泡，两次滤液混合于100 mL 容量瓶，加蒸馏水定容，制得5 种梵净山茶原提取液，移取各茶原提取液1 mL 于10 mL 容量瓶，加水定容，用于各项指标的测定。

梵净山茶中茶多酚物质采用福林酚法[11-12]测定，在OD760nm测吸光值， 标准曲线方程：Y= 0.117 7X-0.001 6，R2=0.999 7。 分别移取5 种梵净山茶原提取液1 mL，测定梵净山茶中茶多酚含量。

1.2.2.2 梵净山茶总黄酮含量的测定

梵净山茶中的总黄酮物质采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法[13-14]测定，在OD510nm测吸光值，标准曲线方程：Y=0.223 9X+0.002 7，R2=0.999 4。 分别移取1.2.2.1中5 种梵净山茶原提取液1 mL，测定梵净山茶中总黄酮含量。

1.2.2.3 梵净山茶总游离氨基酸含量的测定

梵净山茶中的总游离氨基酸含量采用茚三酮法测定[15-16]，分别精确移取浓度10 mg/mL 茶氨酸标准溶液0、1.0、1.5、 2.0、2.5、3.0 mL 置于50 mL 容量瓶，得0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 浓度茶氨酸标准溶液，分别移取1 mL 于25 mL 具塞试管，依次加入pH8.0 磷酸盐缓冲液0.5 mL，再各加入2%茚三酮溶液0.5 mL，恒温沸水浴15 min，取出冰水冷却至室温（25 ℃），加水定容， 在OD570nm测吸光值， 绘得标准曲线方程：Y=1.516 3X-0.007 9，R2=0.999 3。分别移取1.2.1.1 中5 种梵净山茶原提取液1 mL， 以制作标准曲线的方法，每组三水平，测定梵净山茶中总游离氨基酸含量。

1.2.2.4 梵净山茶中茶多糖含量的测定

梵净山茶中茶多糖物质采用苯酚-硫酸法进行测定[17]，以浓度1 mg/mL 葡萄糖标准溶液制得浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 葡萄糖标准溶液，再分别移取上述1 mL 于25 mL 具塞试管， 加入浓度为5%的苯酚溶液1 mL，缓慢加入浓硫酸5 mL，冷却，旋涡均匀混合5 s，静置5 min，恒温沸水浴15 min，置于冰水中冷却至室温（25 ℃），在OD490nm测吸光值，绘得标准曲线方程：Y=10.087X+0.0131，R2=0.999 5。 分别称取5 种梵净山茶粉末5 g，90%乙醇40 mL，60 ℃水浴1 h， 残渣90%乙醇洗涤2～3 次， 滤液混合定容至100 mL，分别移取1 mL，以制作标曲方法，每组三水平，测定梵净山茶中茶多糖含量。

1.2.2.5 梵净山茶维生素C 含量的测定

梵净山茶维生素C 物质采用GB 5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》中第三法进行测定[18]，分别称取5 种梵净山茶粉末1 g，2%草酸溶解，定容至100 mL；移取2%草酸10 mL，加1 mg/mL 抗坏血酸标准液1 mL，2，6-二氯靛酚溶液滴定；分别移取5 种梵净山茶原提取液1 mL 替换抗坏血酸进行滴定，直至溶液产生微红色，15 s 不褪色，空白以蒸馏水为参照，记录数据。

式中：T 为每毫升2，6-二氯靛酚溶液滴定度，mg/mL；C 为抗坏血酸浓度，mg/mL；V 为移取抗坏血酸标准液体积，mL；V1为滴定抗坏血酸溶液所用2，6-二氯靛酚溶液的体积，mL；V2为滴定空白所用2，6-二氯靛酚溶液的体积，mL。

式中：V1为滴定样液所用2，6-二氯靛酚溶液的体积，mL；V0为滴定空白所用2，6-二氯靛酚溶液的体积，mL；T 为每毫升2，6-二氯靛酚溶液滴定度，mg/mL；A 为稀释倍数；W 为样品质量，g。

1.2.3 DPPH 自由基清除率的测定

DPPH 自由基清除率的测定参考陈亮等[19]方法并稍作修改，分别移取5 种梵净山茶10 倍稀释液2 mL，于25 mL 棕色容量瓶，加0.2 mmol/L DPPH 溶液2 mL，室温（25 ℃）避光反应30 min，在OD517nm测吸光值。

DPPH 自由基清除率/%=1-（Ai-Aj）/A0×100

式中：Ai为DPPH 溶液混合后在517 nm 波长处测定的吸光值；Aj为2 mL 无水乙醇+2 mL 稀释液在517 nm 波长处测定的吸光值；A0为2 mL 无水乙醇加2 mL DPPH 溶液在517 nm 波长处测定的吸光值。

1.2.4 清除羟自由基清除率的测定

羟自由基清除率的测定参照黄采姣等ABTS 法[20]并稍作修改， 移取6.3 mmol/L 浓度的邻二氮菲溶液1 mL 于比色管， 移取2 mL 浓度为0.01 mmol/L pH7.4 PBS，精确加入1 mL 无水乙醇，漩涡混合10 s，1 mL 浓度0.75 mmol/L FeSO4溶液， 摇匀， 加1 mL 浓度0.03%H2O2溶液，37 ℃恒温水浴1 h，在OD510nm测吸光值。

式中：A损为混合后溶液在510 nm 波长处测定的吸光值；A样为5 种梵净山茶原提取液代替无水乙醇在510 nm 波长处测定的吸光值；A未损为蒸馏水代替0.03%过氧化氢溶液在510 nm 波长处测定的吸光值。

1.2.5 总抗氧化能力的测定

梵净山茶的总抗氧化能力采用铁离子还原法（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）测定[21]，分别移取5 种梵净山茶100 倍稀释液1 mL，于25 mL 具塞试管，加2 mL FRAP 工作液，37 ℃水浴30 min，取出冷却，OD593nm测吸光值；以1 mmol/L FeSO4溶液为标准溶液， 绘得标准曲线方程：Y=0.000 5X-0.000 1，R2=0.999 3，铁离子还原值越大，其抗氧化能力越强。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0 和Excel 2016 进行数据处理并完成显著水平分析、相关性分析、聚类分析和主成分分析。

2 结果分析

2.1 5 种梵净山茶生物活性成分含量比较分析

梵净山茶的生物活性成分含量测定结果见表1。

由表1 可知，5 种梵净山茶的茶多酚含量为0.64 g/100 g～1.53 g/100 g，茶多酚具有良好的抗氧化和清除自由基的能力[22]；茶多糖含量为27.56 g/100 g～65.31 g/100 g，人体摄取茶多糖有利于血糖、血脂的降低，并且具有抗氧化的作用[23]；游离氨基酸是茶叶中重要的品质成分之一，所含总量的高低直接影响茶叶的鲜爽度[24]，5 种梵净山茶总游离氨基酸含量在0.13 g/100 g～1.95 g/100 g；总黄酮含量在4.41 g/100 g～25.83 g/100 g，维生素C 含量在0.70 mg/100 g～17.03 mg/100 g。5 种生物活性成分在p＜0.05 水平都具有显著性差异， 其中小毛峰茶水溶性的提取物多数高于其余4 种梵净山茶，茶多酚、茶多糖、总黄酮以及维生素C 的含量均值高达（1.53±0.01）、（65.31±0.05）、（25.83±0.12）g/100 g 和（17.03±0.40） mg/100 g。 藤茶的总游离氨基酸含量最低（0.13±0.00）g/100 g，金茯砖茶的总游离氨基酸含量最高（1.95±0.00）g/100 g，是藤茶的15 倍。

表1 梵净山茶的生物活性成分含量测定结果Table 1 Determination of bioactive components in Fanjing Mountain tea

2.2 5 种梵净山茶抗氧化能力分析比较

羟自由基是对人体威胁最大的一类自由基。 抗氧化能力测定结果见表2。

表2 抗氧化能力测定结果Table 2 Determination of antioxidant activity

由表2 可知，5 种梵净山茶对DPPH 自由基清除率有效区域范围72.42%～87.16%， 羟自由基清除率有效区域范围170.91%～214.29%，总抗氧化能力为450.87 μmol/L～1 530.87 μmol/L，5 种梵净山茶均具有较强清除自由基的功效。

根据表2 可知，DPPH 自由基清除能力由强至弱依次为金茯砖茶＞小毛峰＞茗茶＞苔茶＞藤茶，其中金茯砖茶对DPPH 自由基的清除能力最强，清除率均值达到（87.16±0.02）%， 藤茶对DPPH 自由基的清除能力最弱， 但对羟自由基清除能力最强， 清除率均值高达（214.29±0.31）%。 罗冬兰等[25]研究了贵州5 种绿茶的抗氧化活性， 其中苔茶对DPPH 自由基清除能力比其余4 种绿茶弱。本试验对梵净山5 种茶进行研究，结果表明苔茶对DPPH 自由基清除能力比藤茶强， 比金茯砖茶、小毛峰、茗茶弱。 5 种梵净山茶对羟自由基清除能力由强至弱依次为藤茶＞苔茶＞金茯砖茶＞小毛峰＞茗茶。 欧贤红等[26]研究藤茶的抗氧化活性，其结果表明，梵净山藤茶中主要的抗氧化活性物质为黄酮类物质杨梅素和二氢杨梅素。 总抗氧化能力由强至弱的顺序为小毛峰＞藤茶＞茗茶＞金茯砖茶＞苔茶，其中效果最为明显的小毛峰茶Fe3+还原力为（1 530.87±2.31）μmol/L。 马慧等[27]利用铁离子还原力测定4 种梵净山茶的抗氧化活性，最终得出结论绿茶的抗氧化活性是最好的。 小毛峰也属于绿茶的一种，因此本试验研究结果与其结果一致。通过显著性分析表明，5 种梵净山茶的抗氧化能力在0.05 水平存在显著差异。

2.3 5 种梵净山茶的生物活性成分与抗氧化能力相关性

对梵净山茶中的生物活性成分与DPPH 自由基清除率、羟自由基清除率、总抗氧化能力进行相关性分析，见表3。

表3 梵净山茶的生物活性成分与抗氧化能力的相关性分析Table 3 Correlation analysis of the bio-active components and antioxidant capacity of Fanjing Mountain tea

结果表明，DPPH 自由基清除率与维生素C 含量（r=0.573）呈显著正相关；羟自由基清除率与总黄酮含量（r=-0.542）、茶多糖含量（r=-0.515）呈显著负相关，与维生素C 含量（r=-0.643）呈极显著负相关；FRAP 法测定的总抗氧化能力与总黄酮含量（r=0.915）、茶多酚含量（r=0.936）、茶多糖含量（r=0.758）、维生素C 含量（r=0.754）呈极显著正相关。 而总黄酮含量、茶多酚含量、茶多糖含量、总游离氨基酸含量与DPPH 自由基清除率无相关性；茶多酚含量、总游离氨基酸含量与羟自由基清除率无相关性；总游离氨基酸含量与总抗氧化能力无相关性。

此外，相关性分析结果表明，茶多酚与FRAP 法测定总抗氧化能力有极显著相关性，这与金亮等[28]的研究结果相符， 该研究表明FRAP 法适于茶叶抗氧化能力的评价； 维生素C 作为以上3 种方法的清除剂，对5 种梵净山茶进行抗氧化测定时， 与DPPH 自由基清除率有显著正相关，与羟自由基清除率有极显著负相关，与总抗氧化能力有极显著正相关。另外，DPPH 法、羟自由基清除法、FRAP 法均适合茶叶的抗氧化活性测定，并起到互补作用，与韩延超等[29]研究报道相符；DPPH 自由基清除率与总黄酮含量没有显著相关性，与李红梅等[30]研究的苦荞茶结果不同，这可能是由于不同种茶类所含有的黄酮成分不一样， 造成对DPPH自由基清除率不同。

2.4 5 种梵净山茶的生物活性成分的主成分分析

将5 种梵净山茶的生物活性成分的含量测定值经标准化后进行主成分分析， 可以得到5 个变量的相关系数和主成分分析的结果。 对数据进行适应性检验，相关系数矩阵的直观检验[31]。 生物活性成分的相关矩阵见表4。

表4 生物活性成分的相关矩阵Table 4 Correlation matrix of bio-active components

由表4 可知，总黄酮、维生素C、茶多酚、茶多糖两两之间呈极显著正相关，总游离氨基酸与其余4 种指标呈极显著负相关（p<0.01），整体表明各生物活性成分相关性较强，可采用主成分分析对生物活性成分进一步的分析。

主成分分析法是使冗余复杂的信息简单化的分析方法[32]。 采用该法得各主成分的特征值、方差贡献率、 累计方差贡献率。 特征值一般选取大于1 的主成分作为代表[33]。 生物活性成分主成分分析结果见表5。

表5 生物活性成分主成分分析结果Table 5 Results of principal component analysis of bio-active components

由表5 可知，总黄酮特征值是4.854，相当于4.854倍的原始变量的信息量，贡献率高达97.07%，即保留了原始指标97.07%的信息，具有代表性。因此，最终提取总黄酮为主成分进行评价即可，它代表了不同梵净山茶的生物活性的97.07%的信息量。

2.5 5 种梵净山茶及其各生物活性成分的聚类分析

本研究以5 种梵净山茶和生物活性成分为变量，采用SPSS 作聚类分析， 选用Nearest neighbor 法，对5 种梵净山茶样品的聚类采用Q 型聚类， 对其各项指标的聚类采用R 型聚类。得聚类分析的结果见图1。对5 种梵净山茶各生物活性成分聚类分析见图2。

图1 5 种梵净山茶的聚类分析树状图Fig.1 Tree diagram of cluster analysis of five kinds of Fanjing Mountain Tea

图2 生物活性成分的聚类分析树状图Fig.2 Cluster analysis tree of bio-active components

当5 种梵净山茶分为2 类时，藤茶、金茯砖茶、苔茶聚为一类，茗茶、小毛峰茶为一类；当分为3 类时，藤茶、金茯砖茶聚为一类，茗茶、小毛峰茶为一类，苔茶聚为一类；当分为4 类时，藤茶、金茯砖茶聚为一类，茗茶、小毛峰、苔茶各自为一类。从3 种分类标准中可知，藤茶和金茯砖茶都可聚为一类，可见两者的相似度极高，当分为2 类和3 类时，茗茶、小毛峰茶可聚为一类，说明两者也具有较大的相似度，苔茶明显区分于其余4 种梵净山茶。

由图2 可知，当分为2 类时，茶多酚、茶多糖、总黄酮、维生素C 一类，总游离氨基酸为一类；当分为3 类时，多酚、茶多糖、维生素C 一类，总黄酮为一类，总游离氨基酸为一类。 这种聚类结果可能与梵净山茶的生产、加工方式和茶叶的生长环境、土壤的相互作用有关。

3 结论

本试验对藤茶、茗茶、苔茶、小毛峰、金茯砖茶5 种梵净山茶进行研究，试验结果表明，5 种梵净山茶在总黄酮、茶多酚、茶多糖、总游离氨基酸、维生素C 等指标含量方面存在显著性差异（p<0.05），在DPPH 自由基清除率、羟自由基清除率和总抗氧化能力存在显著性差异（p<0.05）。 同时运用相关性分析对各生物活性成分之间的相关性以及生物活性成分与抗氧化能力之间的相关性进行了探究， 得到DPPH 自由基清除率与维生素C 含量呈显著正相关，羟自由基清除率与总黄酮含量、茶多糖含量呈显著负相关，总游离氨基酸含量与总黄酮、茶多酚、茶多糖、维生素C 呈极显著相关，而与总抗氧化能力无相关性，这可能与茶叶加工过程时微生物的污染、加工方式使总游离氨基酸发生复杂化学变化所致。 其中小毛峰茶的总黄酮含量、茶多糖含量、茶多酚含量和维生素C 含量是最高的，这4 种生物活性成分与总抗氧化能力是极显著相关，表明小毛峰茶具有强抗氧化能力。 通过主成分分析可以得到总黄酮为主成分，它可以反映梵净山茶中生物活性成分97.07%的信息，而后对5 种梵净山茶进行聚类分析，发现不管如何分类，藤茶和金茯砖茶都是聚为一类，说明两者具有较大的相似度。

本试验采用多元统计分析结果旨在为广大消费者的购茶、饮茶选择提供一定的科学依据，为梵净山茶今后抗氧化活性的评价提供更加便捷快速的途径。同时， 更有代表性说明梵净山茶总抗氧化能力较高，为提高梵净山茶的广泛开发和综合利用，提供了一定的参考理论依据。