视网膜Sigma-1受体拮抗剂对豚鼠形觉剥夺性近视形成的抑制作用及其机制

陈媛媛 谢伏娟 李海波 关宇欣 毛俊峰

1中南大学湘雅医院眼科中心 眼科学湖南省重点实验室，长沙 410008；2中南大学湘雅医院手术部，长沙 410008

Sigma-1受体是在豚鼠克隆的一种细胞内分子伴侣，主要位于线粒体相关的内质网膜，具有调节内质网应激、神经递质、离子通道活性等生理功能[1]。Sigma-1受体表达于大多数视网膜神经元和胶质细胞，在视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)层表达最为丰富，在Müller细胞、光感受器细胞、双极细胞、无长突细胞均有表达[2-3]。研究发现，Sigma-1受体激活后与多巴胺转运体(dopamine transporter，DAT)结合，抑制突触间隙的多巴胺向细胞内转运，造成细胞外多巴胺浓度升高[4]。目前的研究证实，视网膜多巴胺参与近视，尤其是形觉剥夺性近视(form deprivation myopia，FDM)的形成过程[5-6]。本课题组先前的研究发现，FDM豚鼠视网膜中多巴胺含量下降，腹腔内注射左旋多巴能够通过升高视网膜多巴胺含量抑制FDM形成[7]。另有研究发现，FDM豚鼠视网膜中多巴胺及其代谢产物含量下降，调控视网膜多巴胺含量能够影响豚鼠FDM的形成[8]。目前尚不清楚视网膜Sigma-1受体是否参与近视的形成，基于上述研究结果，我们推测视网膜Sigma-1受体可能通过调节视网膜多巴胺含量而参与近视的形成。本研究拟探讨视网膜Sigma-1受体在豚鼠FDM形成和恢复过程中的变化，并通过球周注射Sigma-1受体特异性拮抗剂N，N-二乙基-2-(4-甲氧基-3-苯乙基氧基苯基)乙胺盐酸盐(N,N-dipropyl-2-[4-methoxy-3-(2-phenylethoxy)-phenyl]-ethylaminemonohydrochloride，NE-100)观察其对FDM形成及视网膜多巴胺含量的影响，研究视网膜Sigma-1受体在豚鼠FDM形成中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 选取健康21日龄三色豚鼠85只(中南大学实验动物学部提供)，体质量140～170 g，雌雄不限。本研究经中南大学实验动物学部伦理委员会批准(批文号：2020sydw0084)，实验动物的使用和喂养完全遵循中国科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。

1.1.2主要试剂及仪器 兔多克隆Sigma-1受体抗体(ab151288)、鼠抗兔GAPDH多克隆抗体(ab181603)、羊抗兔二抗(ab97051)(美国Abcam公司)；Sigma-1受体选择性拮抗剂NE-100(SML0631，美国Sigma-Aldrich公司)；超敏两步法免疫组织化学检测试剂盒(PV-0023)、BCA蛋白定量试剂盒(C05-02001)(北京博奥森生物技术有限公司)。ARK-510A电脑验光角膜曲率计(日本尼德克公司)；MD-2400S眼科A/B型超声诊断仪(天津迈达医学科技股份有限公司)；艾沃斯-V8数字式照度计(武汉中测宏图测量仪器有限公司)；KF-PRO-005全自动数字病理切片扫描仪(宁波江丰生物信息技术有限公司)；Waters 2695型高效液相色谱仪、Waters uBondapak C18反相色谱柱(美国沃特世公司)。

1.2 方法

1.2.1实验动物分组处理 实验分为2个部分进行，第1部分纳入豚鼠36只，采用随机数表法分为正常对照组、眼遮盖14 d组和眼遮盖11 d组，每组12只，其中正常对照组不予遮盖，眼遮盖14 d组用自制半透明眼罩连续遮盖豚鼠右眼14 d作为FDM模型组，眼遮盖11 d组同法连续遮盖右眼11 d后去遮盖3 d，评估视网膜Sigma-1受体在豚鼠FDM形成及恢复过程中的变化。另取49只豚鼠，采用随机数表法将其分为FDM组10只、FDM+NE-100 6 μg组12只、FDM+NE-100 60 μg组10只、FDM+NE-100 600 μg组9只和FDM+生理盐水组8只，研究阻断视网膜Sigma-1受体活性对豚鼠FDM眼球屈光发育的影响。依据上述不同NE-100的作用结果，将NE-100 60 μg作为多巴胺测定实验最适药物计量，并比较FDM+NE-100 60 μg组与FDM组豚鼠实验眼视网膜中多巴胺质量分数的差异。

1.2.2豚鼠FDM模型的制作 在本课题组以前FDM模型制作方法[7,9]的基础上制作豚鼠FDM模型。以右眼为遮盖眼，以乳胶手套为材料制作半透明遮盖眼罩，用系带固定于豚鼠头部。每日清洗眼罩1次，保持其清洁。分笼饲养，每天光照与黑暗周期为12 h/12 h，7：00—19：00为连续室内日光灯照明时间，每天采用数字式照度计测量笼内豚鼠眼水平面的光照度，控制在480～520 lx。按照预定实验时间，采用电脑验光角膜曲率计测定眼球相对屈光度和角膜曲率半径(精确到0.01 mm)，A型超声仪测量眼轴长度(精确到0.01 mm)，每眼测量3次，取平均值，评估眼球屈光状态变化。于遮盖后14 d，腹腔内注射过量戊巴比妥钠处死豚鼠，摘除眼球。

1.2.3免疫组织化学染色法检测视网膜Sigma-1受体蛋白表达分布 正常对照组、眼遮盖14 d组和眼遮盖11 d组各任意选取3个标本，用2.5 ml一次性注射器针头在角膜扎2～3个孔，将眼球置于质量分数10%中性甲醛中固定，石蜡包埋，制作5 μm厚眼球石蜡切片，用于免疫组织化学染色，一抗为兔多克隆Sigma-1受体抗体，工作浓度为1∶ 100。参照免疫组织化学检测试剂盒步骤进行显色，采用全自动数字病理切片扫描仪扫描切片并采集、保存图像。

1.2.4Western blot法检测视网膜Sigma-1受体蛋白的表达 正常对照组、眼遮盖14 d组和眼遮盖11 d组每组各9个标本用于Western blot检测。取豚鼠视网膜神经上皮层标本，称量后剪碎。按1∶ 10体积比加入细胞裂解液匀浆，4 ℃、9 000×g离心15 min，取上清液，-20 ℃冻存。采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。取蛋白样品25 μg，一抗为兔多克隆Sigma-1受体抗体，工作浓度为1∶ 500。采用Bandscan5.0图像分析软件对目的条带进行灰度分析，以GAPDH为内参，计算Sigma-1受体蛋白的相对表达量。Sigma-1受体蛋白相对表达量=Sigma-1受体条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

1.2.5NE-100给药方式 NE-100使用时新鲜配制，以生理盐水为溶剂。参照Jiang等[9]的方法，采用盐酸奥布卡因滴眼液点眼局部麻醉，采用30G一次性注射器于每天9：00给豚鼠实验眼球周注射100 μl NE-100，每天1次，连续14 d。NE-100的注射量分别为6、60和600 μg，以球周注射100 μl生理盐水作为对照。

1.2.6高效液相色谱电化学法测定神经视网膜多巴胺含量 FDM组和FDM+NE-100 60 μg组每组各10个标本用于神经视网膜多巴胺含量测定。取豚鼠视网膜神经上皮层标本，称量后液氮保存。色谱条件：Waters uBondapak C18反相色谱柱(150 mm×3.9 mm，5 μm)，流动相为水相(每500 ml含B81.25 g、KH2PO46.8 g、EDTA 18 mg，pH=3.3)，有机相V甲醇∶V水∶V乙腈=78∶ 19∶ 3，流速为0.75 ml/min，工作电压为0.7 V，进样量为10 μl。多巴胺的保留时间为6.2 min。计算神经视网膜内多巴胺质量分数(ng/mg)。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行统计分析。计量资料的数据经Shapiro-Wilk检验证实呈正态分布，以mean±SD表示。采用随机分组单因素干预多水平研究设计，各组间豚鼠角膜曲率半径、眼球屈光度、眼轴长度和视网膜Sigma-1受体蛋白相对表达量总体差异比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。FDM组与FDM+NE-100 60 μg组豚鼠实验眼视网膜多巴胺质量分数比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组眼球屈光状态的变化

各组间豚鼠屈光度和眼轴长度总体比较，差异均有统计学意义(F=147.81、160.10，均P<0.01)，其中与正常对照组比较，眼遮盖14 d组和眼遮盖11 d组豚鼠遮盖眼相对近视度数明显加深，眼轴明显延长，差异均有统计学意义(均P<0.05)；与眼遮盖14 d组比较，眼遮盖11 d组相对近视度数明显较低，眼轴较短，差异均有统计学意义(均P<0.05)。各组间豚鼠角膜曲率半径总体比较差异无统计学意义(F=0.80，P>0.05)(表1)。

表1 各组豚鼠实验眼角膜曲率半径、屈光度及眼轴长度的比较(mean±SD)Table 1 Comparison of corneal curvature radius,diopter and axial length among different groups (mean±SD)组别眼数角膜曲率半径(mm)屈光度(D)眼轴长度(mm)正常对照组123.54±0.04+1.54±0.547.94±0.06眼遮盖14d组123.56±0.05-2.83±0.75a8.37±0.07a眼遮盖11d组123.55±0.04-1.25±0.58ab8.18±0.04abF值0.80147.81160.10P值>0.05<0.01<0.01 注:与各自正常对照组比较,aP<0.05;与眼遮盖14d组比较,bP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验) Note:Compared with the normal control group,aP<0.05;compared with the occluded 14-day group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test)

2.2 各组豚鼠实验眼视网膜Sigma-1受体蛋白表达

免疫组织化学染色结果显示，Sigma-1受体蛋白表达于正常豚鼠的多数RGCs和光感受器内节以及少量内核层细胞，呈淡黄色染色。遮盖14 d组遮盖眼视网膜Sigma-1受体蛋白在RGCs及光感受器内节染色明显增强，内核层细胞Sigma-1受体蛋白阳性细胞明显增多，内、外丛状层均可见Sigma-1受体蛋白阳性表达，栅栏状排列的Müller细胞染色尤为明显。与遮盖14 d组比较，遮盖11 d组遮盖眼视网膜Sigma-1受体蛋白在RGCs、光感受器内节阳性染色强度明显减弱，内核层仅存在少量Sigma-1受体蛋白阳性细胞，内、外丛状层及栅栏状排列的Müller细胞无明显染色(图1)。Western blot检测发现，正常对照组、遮盖14 d组和遮盖11 d组豚鼠遮盖眼中Sigma-1受体蛋白相对表达量分别为0.13±0.04、0.42±0.11和0.17±0.06，总体比较差异有统计学意义(F=36.78，P<0.01)，其中遮盖14 d组遮盖眼视网膜Sigma-1蛋白相对表达量较正常对照组明显升高，遮盖11 d组遮盖眼视网膜Sigma-1受体蛋白相对表达量明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.01)(图2)。

图1 免疫组织化学染色法检测不同眼遮盖组豚鼠视网膜中Sigma-1受体蛋白表达(DAB ×400，标尺=20 μm) A：正常对照组豚鼠实验眼视网膜不同细胞中Sigma-1受体蛋白表达呈淡黄色 B：眼遮盖14 d组豚鼠实验眼视网膜中Sigma-1受体蛋白表达细胞增多，染色增强 C：眼遮盖11 d组豚鼠实验眼视网膜中Sigma-1受体蛋白表达细胞少于眼遮盖14 d组，染色强度减弱

图2 Western blot法检测不同眼遮盖组豚鼠视网膜中Sigma-1受体蛋白表达量 A：视网膜中Sigma-1受体蛋白表达电泳图 眼遮盖14 d组视网膜中Sigma-1受体蛋白表达条带强于正常对照组和眼遮盖11 d组 GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶 B：各组视网膜中Sigma-1受体蛋白相对表达量比较 F=36.78，P<0.01.与正常对照组比较，aP<0.01；与眼遮盖14 d组比较，bP<0.01(单因素方差分析，LSD-t检验，n=9) 1：正常对照组；2：眼遮盖14 d组；3：眼遮盖11 d组

2.3 不同剂量NE-100干预组眼屈光度变化及视网膜多巴胺质量分数比较

不同NE-100干预组豚鼠实验眼角膜曲率半径总体比较差异无统计学意义(F=0.38，P>0.05)；各组豚鼠实验眼屈光度和眼轴长度总体比较差异均有统计学意义(F=27.51、24.04，均P<0.01)。与FDM组比较，FDM+NE-100 6 μg、60 μg和600 μg组实验眼屈光度绝对值逐渐下降，眼轴长度逐渐缩短，差异均有统计学意义(均P<0.05)；FDM+生理盐水组与FDM组实验眼屈光度和眼轴长度变化差异均无统计学意义(均P>0.05)(表2)。FDM组和FDM+NE-100 60 μg组豚鼠实验眼视网膜中多巴胺质量分数分别为(0.57±0.10)ng/mg和(0.74±0.09)ng/mg，组间比较差异有统计学意义(t=15.18，P<0.01)(图3)。

表2 各组豚鼠实验眼屈光相关指标比较(mean±SD)Table 2 Comparison of refractive parameters of guinea pigs among different groups (mean±SD)组别眼数角膜曲率半径(mm)屈光度(D)眼轴长度(mm)FDM组103.55±0.04-2.75±0.728.35±0.07FDM+NE-100 6μg组123.54±0.05-1.58±0.76a8.25±0.08aFDM+NE-100 60μg组103.56±0.04-0.35±0.67ab8.12±0.06abFDM+NE-100 600μg组93.54±0.05-0.28±0.57ab8.11±0.05abFDM+生理盐水组83.56±0.06-2.63±0.698.34±0.08F值0.3827.5124.04P值>0.05<0.01<0.01 注:与FDM组比较,aP<0.05;与FDM+NE-100 6μg组比较,bP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验) FDM:形觉剥夺性近视;NE-100:N,N-二乙基-2-(4-甲氧基-3-苯乙基氧基苯基)乙胺盐酸盐 Note:Compared with the FDM group,aP<0.05;compared with the FDM+NE-100 6μg group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) FDM:form dep-rivation myopia;NE-100:N,N-dipropyl-2-[4-methoxy-3-(2-phenylethoxy)-phen-yl]-ethylaminemonohydrochloride

图3 FDM组与FDM+NE-100 60 μg组豚鼠实验眼视网膜中多巴胺质量分数比较 与FDM组比较，aP<0.01(独立样本t检验，n=10) FDM：形觉剥夺性近视；NE-100：N，N-二乙基-2-(4-甲氧基-3-苯乙基氧基苯基)乙胺盐酸盐

3 讨论

研究发现，Sigma-1受体在大鼠、小鼠、人、猴等哺乳动物视网膜中分布广泛，RGCs、光感受器细胞、双极细胞及Müller细胞等均有表达，尤其是RGCs[3]。本研究发现，豚鼠中Sigma-1受体蛋白主要表达在RGCs、光感受器内节细胞及少量内核层细胞，FDM引起视网膜中Sigma-1受体蛋白表达量升高，Sigma-1受体蛋白阳性细胞明显增多，Müller细胞中Sigma-1受体蛋白表达增强更为明显，豚鼠短期遮盖后去遮盖眼近视程度降低，视网膜Sigma-1受体蛋白表达也减弱，接近正常对照眼水平。由此可见，豚鼠FDM形成及恢复过程中视网膜Sigma-1受体蛋白表达发生相应变化，尤其是内核层细胞。以上结果表明视网膜Sigma-1受体激活在眼罩遮盖诱导豚鼠FDM形成过程中可能起促进作用。

本研究还通过球周注射Sigma-1受体拮抗剂NE-100验证视网膜Sigma-1受体蛋白是否能影响豚鼠FDM的形成过程，结果发现注射后可引起遮盖眼近视度降低、眼轴延长幅度变小，表明NE-100对FDM的形成有抑制作用，但NE-100并不能完全阻止豚鼠FDM的形成，其中60 μg剂量的NE-100对FDM的抑制作用更为明显。结合豚鼠FDM形成及恢复过程中视网膜Sigma-1受体蛋白的表达变化，表明视网膜Sigma-1受体拮抗剂在豚鼠FDM形成过程中具有抑制作用。

DAT是位于多巴胺能神经元突触前膜的一种跨膜蛋白，可将多巴胺从细胞外迅速转运到突触前神经元胞质内，维持神经元内外多巴胺的稳态。无多巴胺结合时DAT处于向外构象，与多巴胺结合后DAT转变为向内构象，把多巴胺转运到细胞质内，再恢复为向外构象[10]。Hong等[4]研究发现，激活的Sigma-1受体能与DAT结合，促进DAT转变为向外构象，加快细胞外多巴胺向细胞内转运的过程，进而降低视网膜多巴胺含量，促进FDM形成。本研究结果发现，球周注射NE-100可引起豚鼠视网膜多巴胺含量升高，表明NE-100对FDM的抑制作用可能与视网膜多巴胺含量的升高有关。NE-100抑制FDM形成可能与其拮抗视网膜Sigma-1受体，从而减慢DAT转变为向外构象，导致细胞外多巴胺向细胞内转运减少有关。此外，视网膜DAT自身也参与FDM的形成，Zhao等[11]用99mTc-TRODAT-1 SPECT DAT显像技术研究发现豚鼠FDM视网膜DAT数量减少，这与FDM视网膜多巴胺合成、代谢降低相适应。

多巴胺是视网膜中一种重要的神经递质，与眼球的屈光发育及近视形成密切相关。多巴胺的合成源于酪氨酸，酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)是合成多巴胺的限速酶。新合成的多巴胺被转运至多巴胺能神经元的突触囊泡，光照能刺激其释放到突触间隙，作用于突触前后膜及突触外的多巴胺受体，完成多巴胺能信号传递。DAT又把突触间隙中的多巴胺转运回细胞内，重新进入突触囊泡或被单胺氧化酶代谢成3，4-二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)。研究表明，视网膜多巴胺是近视的一个抑制信号，豚鼠、鸡等FDM的视网膜多巴胺及其代谢产物DOPAC均降低[7,12]，腹腔内注射左旋多巴或玻璃体腔内注射多巴胺均能有效抑制FDM形成[7,13]。FDM视网膜中多巴胺含量下降与TH降低、多巴胺合成减少有关[14-16]，此外本研究提示形觉剥夺引起视网膜Sigma-1受体激活也是一个因素，可能与Sigma-1受体激活引起DAT构象变化，进而导致细胞外多巴胺向细胞内转运加快有关。

综上所述，本研究结果表明形觉剥夺能引起豚鼠FDM视网膜Sigma-1受体表达增强，球周注射Sigma-1受体拮抗剂NE-100能抑制FDM形成，且这一作用与其引起视网膜多巴胺含量变化有关。视网膜Sigma-1受体激活是否通过引起DAT构象变化，导致FDM视网膜多巴胺含量下降，仍有待进一步研究加以证实。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突