口虾蛄总生物碱对人非小细胞肺癌A549细胞增殖的抑制作用

齐相薇，蔡康荣，林荣文，王槐高 （广东医科大学.临床技能培训中心；.科研中心；3.病理生理学教研室，广东东莞 53808）

原发性支气管肺癌（简称肺癌）是我国最常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌总发病率的85%左右[1]。NSCLC 细胞对放疗和化疗的敏感度相对较低，对于不能手术切除的癌症患者，多数患者接受放化疗后病情虽然得到局部控制，但只有少数患者能够治愈[2]。随着对NSCLC 相关驱动基因的发现，对NSCLC 患者的治疗迎来了更个体化的靶向治疗时代。在临床应用中，靶向治疗如何克服靶向药物应用过程中出现的原发及获得性耐药问题，是其最大挑战。确定基因突变患者的耐药机制和非突变非小细胞肺癌患者的新治疗方法仍然是一个需深入研究的领域[3]。因此，寻找高效、低毒的抗癌药物对肺癌的防治及提高中晚期肺癌患者的生存质量，也是肺癌防治研究的发展趋势之一。海洋生物不仅具有独特、新颖的结构，而且具有强大的药理活性，海洋来源的天然产物已经成为抗肿瘤药物的重要来源[4]。海洋生物碱是一类重要的海洋生物次级代谢产物，具有抗菌、抗炎和抗肿瘤等多方面的生物活性，是优良的药物先导化合物。研究证明，中国广西北海涠洲岛海域的陵水山海绵Mycale lingshuiensis中含有4个单吲哚生物碱[5]。有研究发现海洋生物碱Ropalladins 类似物对宫颈癌Caski 细胞有抑制增殖和诱导凋亡的作用[6]。现已发现70 多个不同的Lamellarins 及与它们结构类似的天然吡咯类生物碱，具有优良抗肿瘤活性、多药耐药逆转活性及抗菌活性，是医药发展领域潜在的候选药物[7]。近年来本课题组研究发现，口虾蛄乙酸乙酯提取物与传统化疗药物的联合用药，增加了传统化疗药物对肝癌细胞的毒性作用，呈现出低浓度拮抗，高浓度协同的作用[8]。本文结合前期的研究结果，通过改进提取方法得到口虾蛄总生物碱，并观察其对A549 细胞的增殖抑制活性，为进一步的开发应用提供实验理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

人非小细胞肺癌A549细胞由广东医科大学肿瘤研究所提供。新鲜口虾蛄（经鉴定属节肢动物门，甲壳纲，口足目，虾蛄科品种）。RPMI 1640 培养基(GIBCO)，小牛血清(四季青生物材料工程公司)，Cell Counting Kit-8（CCK-8）（日本同仁株式会社化学研究所），DMSO(Sigma)；DMSO(Sigma)，细胞周期检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），其他试剂均为国产分析纯。

1.2 口虾蛄总生物碱的提取

新鲜口虾蛄绞碎，以水调入浓盐酸浸泡过夜，离心后取上清液，调入浓氨水碱化至pH＞10。静置过夜，离心后沉淀以乙酸乙酯萃取3 次，减压浓缩沉淀，得到提取物即总生物碱。

1.3 CCK-8法检测体外抗癌效果

选用对数生长期的人肺癌A549细胞，培养24h，加入总生物碱使终质量浓度分别为5、25、125、625 mg/L，培养48 h 后，进行CCK-8 实验，于酶标仪上450 nm 波长处检测各孔的光密度OD 值，按试剂盒说明，计算细胞增殖抑制率。抑制率%=（1－实验组OD值/对照组OD值）×100%。采用Bliss法计算48 h各提取物的IC50值。

1.4 平板克隆实验检测细胞克隆形成能力

取对数生长期A549 细胞，以400 个细胞/孔接种到6 孔板，培养24 h 后给予不同质量浓度（0、50、100 mg/L）总生物碱处理，每组设3个平行孔，连续培养约2 周；用PBS 清洗细胞2 次，甲醇固定15 min 后，0.4%结晶紫染色15 min，流水冲洗；将平皿倒置并叠加1 张带网格的透明胶片，在显微镜（低倍镜）计数大于10 个细胞的克隆数，最后计算克隆形成率。克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。

1.5 流式细胞仪检测细胞周期分布

取对数生长期A549 细胞接种于6 孔板，待细胞长至合适满度后换无血清培养基培养24 h，再给予不同质量浓度（0、50、100 mg/L）总生物碱处理24 h，每组设3 个平行孔；收集细胞，加入预冷的70%乙醇固定，4 ℃过夜；离心后加入终质量浓度为100 mg/L RNAase 和100 mg/L PI 染色液400 μL，混匀，室温避光染色30 min；采用BD FACSCantoⅡ流式细胞仪进行检测分析。

1.6 统计学处理

应用SPSS 18.0及Graph-pad prism 统计学软件处理和分析实验数据，计量资料采用单因素方差分析及q检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 口虾蛄总生物碱对A549细胞生长的影响

作用24、48、72 h 后，口虾蛄总生物碱对A549 细胞活性的抑制如图1所示，呈时间-剂量效应关系降低A549 细胞的存活率。采用Bliss 算法软件统计得到，其作用于A549 细胞24、48 和72 h 的IC50分别为（628.93±0.81）、（135.31±0.50）、（81.51±0.46）mg/L。

图1 总生物碱对A549细胞增殖的抑制作用

2.2 口虾蛄总生物碱对A549 细胞克隆形成能力的影响

口虾蛄总生物碱（0、50、100 mg/L）作用2 周后，各组细胞克隆形成率分别为62%、38.25%、24.25%。随着总生物碱质量浓度的增加，A549 细胞克隆形成数目和克隆形成大小均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。表明口虾蛄总生物碱呈时间-剂量效应关系抑制A549细胞的增殖。

图2 总生物碱抑制A549细胞的克隆形成能力

2.3 口虾蛄总生物碱对A549细胞周期的影响

与对照组相比，口虾蛄总生物碱能诱导A549 细胞周期的G0/G1期比例由84%下降为59.8%,G2/M 期比例由2.27%上升为12.4%，呈时间-剂量效应关系,见图3。

图3 总生物碱对A549细胞周期分布的影响

3 讨论

肺癌是肺部原发性肿瘤中最常见的类型。全球范围内，肺癌的发病率、死亡率都极高且呈现上升趋势。目前晚期NSCLC一线化疗仍以含铂双药方案为主，DDP+PEM/GEM 为优选的基准方案，化疗联合EGFR-TKI/VGFR-TKI 均有获益，化疗后维持治疗目前在临床上也广泛应用。EGFR 和RAS/MEK/ERK双通路抑制联合应用有望成为潜在的治疗方式，有研究发现一线运用吉非替尼治疗EGFR 敏感突变的晚期非小细胞肺癌疗效优于采用化疗者[9]，而EGFR 靶点可能是鳞状细胞肺癌治疗的新方向[10]，但由于肿瘤耐药性的产生[11]，迫切需要疗效好、不良反应小和安全性高的抗NSCLC药物。

丰富多样的海洋生物及次生代谢产物，有着多样性的结构和丰富的生物活性，使其成为新药研发中先导化合物的重要来源[12]。目前世界上广泛使用的抗癌药物中近半数源自海洋天然产物，如海鞘来源属于生物碱类化合物的曲贝替定已经上市，它在结构上属于四氢异喹啉类天然产物，其四氢异喹啉环能够嵌入DNA 小沟并产生相互作用，从而诱发DNA 双链断裂导致细胞死亡，这意味着以往对紫杉醇及艾日布林耐药的患者,以曲贝替定治疗可能有不错的效果[13]。目前尚有2 类生物碱来源的化合物（红树海鞘来源的Lurbinectedin 及河豚来源的替曲朵辛）已进入三期临床相关抗肿瘤试验[14]。我们前期的研究发现口虾蛄乙醇提取物在体外能有效地抑制鼻咽癌CNE-2Z 细胞增殖的生长[15]，在体内对CNE-2Z 裸鼠移植瘤的生长能具有一定的抑制作用[16]。但前期应用乙醇提取法及系统溶剂提取法所得的提取物，成分复杂且抗肿瘤活性物质含量不高，故本文采用酸提碱沉法剔除部分杂质，再采用乙酸乙酯萃取，以便提取成分更简单的总生物碱。本文中，经CCK8 法检测，发现口虾蛄总生物碱可以明显抑制A549 细胞的增殖，作用48 h后IC50比以往方法的提取物更低。经不同质量浓度的口虾蛄总生物碱作用2 周后，随着总生物碱质量浓度的增加，A549 细胞克隆形成数目和克隆形成大小均降低，提示口虾蛄总生物碱呈时间-剂量效应关系抑制A549 细胞的增殖。口虾蛄总生物碱能诱导A549 细胞周期的G0/G1期比例下降，而G2/M 期比例上升，并呈时间-剂量效应关系，表明口虾蛄总生物碱能诱导A549细胞周期阻滞于G2/M期。

综上所述，本文所采用的提取方法所得总生物碱体外抗肿瘤活性较高，其抑制A549 细胞增殖的机制可能是诱导了细胞周期阻滞，总生物碱的纯化及体内抗肿瘤活性仍需进一步实验研究。