HPLC法同时测定紫苏子中迷迭香酸、芹菜素和木犀草苷的含量

权勤波，宋建建，陈淑梅，孙俊英

(1.东营市食品药品检验中心，山东 东营 257091；2.东营市河口区市场监督管理局，山东 东营 257200)

紫苏子为唇形科植物紫苏[Perillafrutescens(L.)Britt.]的干燥成熟果实,始载于《名医别录》，列为中品。具有降气化痰、止咳平喘、润肠通便的功效[1]。用于痰雍气逆、咳嗽气喘、肠燥便秘[2]，常被应用于中药制剂如苏子降气丸[3]、橘红丸[4]、橘红化痰丸等，历版《中国药典》中紫苏子有效成分仅收载了迷迭香酸单成分含量测定，目前研究文献显示，其活性成分检测仅包含迷迭香酸单成分[5]或迷迭香酸与熊果酸[6]，或与木犀草素等双成分的测定[7]，为了更安全有效快速的控制紫苏子的质量，本文研究建立迷迭香酸、芹菜素、木犀草苷同时测定的高效液相色谱法方法，该法简单，快捷，重现性好，准确度高，实用性强，可更好的评价其整体质量。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT型液相色谱仪、XS205DU电子分析天平、KQ-500B型超声波清洗器，甲醇为色谱纯试剂，水为纯化水，其他试剂为分析纯。迷迭香酸(批号：111871-201706，纯度：90.5%)、芹菜素对照品(批号：111901-201603,纯度：99.2%，置五氧化二磷干燥器中减压干燥12 h后使用)、木犀草苷对照品(批号：111720-201408,纯度：94.9%)均购自中国食品药品检定研究院，紫苏子样品(经中鲁医院邵林主任鉴定)均购自当地药房。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Agilent Eclipse C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以0.1%冰醋酸溶液为流动相A,以甲醇为流动相B，梯度洗脱见表1，进样体积10 μL，检测波长320 nm，柱温30 ℃，流速1.0 mL·min-1，色谱图见图1～2。

表1 梯度洗脱时间表

1.迷迭香酸;2.芹菜素;3.木犀草苷

1.迷迭香酸;2.芹菜素;3.木犀草苷

2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末(过二号筛)约1.5 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇约20 mL超声处理(功率250 W，频率 40 kHz)30 min，取出，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取迷迭香酸对照品16.11 mg、芹菜素对照品14.75 mg、木犀草苷对照品14.95 mg分别置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释定容至刻度线，摇匀，作为对照品储备液备用。按需用甲醇稀释至相应的浓度。

分别精密量取上述3种对照品溶液各5 mL，用甲醇稀释并定容至50 mL容量瓶中，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.4 条件的优化

2.4.1 色谱条件的优化 本试验比较了甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.1%冰醋酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%冰醋酸流动相的分离效果。流动相为甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%磷酸时，对照品色谱图中，目标成分不能完全分离；采用乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸作流动相，不断调整比例，供试品中迷迭香酸不能达到基线分离，且拖尾严重；采用甲醇-0.1%冰醋酸、乙腈-0.1%冰醋酸，在合适的梯度条件下，对照品色谱图中，目标成分能够完全分离，峰形对称，但考虑到甲醇毒性较乙腈更小，冰醋酸更安全，故选用甲醇-0.1%冰醋酸为流动相，梯度洗脱。

2.4.2 波长的优化 通过DAD检测供试品所有波长的吸收情况，综合比较220、268、320、365 nm各波长的峰强度、峰数量与保留时间，最终选择320 nm为检测波长。

2.4.3 提取溶剂的选择 查阅文献[8]，甲醇超声处理即可将3种成分全部提取，试验证明，干扰峰较少，故选择甲醇作为溶剂。

2.4.4 提取方法的优化 采用甲醇加热回流30 min、1 h、2 h、3 h与甲醇超声30、45 min对比提取方法，发现加热回流2 h后，有效成分溶出量增加较少，但相比甲醇超声30 min的溶出量几近相等，故选择时间成本低、操作简单、且可批量试验的超声30 min为提取方法。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系 精密吸取混合对照品溶液1、2、5、10、20、50 μL注入液相色谱仪中，以进样量为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果在相应进样范围内呈良好的线性关系(见表2)。

表2 线性关系试验结果(n=6)

2.5.2 精密度试验 精密吸取“2.3”项下混合对照品溶液10 μL，重复进样5次，测定峰面积，迷迭香酸、芹菜素、木犀草苷RSD分别为0.33%、0.14%、0.27%(n=5)，结果表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 取供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10 h进样10 μL，测定峰面积，迷迭香酸、芹菜素、木犀草苷RSD分别为0.68%、0.12%、0.49%(n=6)。试验结果表明，供试品在10 h内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 精密称取同一批样品6份，照“2.2”项下方法制备供试品液，进样10 μL测定峰面积，迷迭香酸、芹菜素、木犀草苷RSD分别为0.81%、0.54%、0.48%(n=6)。表明分析方法重现性好。

2.5.5 加样回收率试验 精密称取6份已测知迷迭香酸、芹菜素、木犀草苷含量的紫苏子S5样品粉末(过二号筛)约0.75 g，精密称定，分别置于6个25 mL容量瓶中，分别准确加入对照品溶液：迷迭香酸5 mL(0.583 mg·mL-1)、芹菜素10 mL(0.058 5 mg·mL-1)、木犀草苷5 mL(0.059 6 mg·mL-1)，再分别用甲醇定容至25 mL，按“2.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，进样10 μL测定峰面积，计算回收率，迷迭香酸、芹菜素、木犀草苷的平均回收率(n=6)分别为99.84%，RSD为0.25%；99.83%，RSD为0.77%；98.39%，RSD为1.07%，结果分别见表3～5。

表3 迷迭香酸加样回收率测定结果

表4 芹菜素加样回收率测定结果

2.6 样品测定 取样品，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别取供试品溶液及对照品溶液各10 μL进样测定峰面积，用外标法(峰面积)计算含量，结果见表6。

表5 木犀草苷加样回收率测定结果

表6 样品含量测定结果(%)(n=3)

3 讨论

3.1 本试验分别考察了流动相类型、流动相不同比例的洗脱效果，最终筛选出甲醇-0.1%冰醋酸溶液梯度洗脱系统适用性试验良好，在同一体系同时测定3种成分的色谱条件,并采取了简单的超声处理30 min处理方法，大大降低了提取时间,且毒性较小，3种成分在20 min内全部完全分离，降低了分析时间，本方法简便、快速、可靠，适用于紫苏子的药材质量分析。

3.2 采用HPLC法首次检出木犀草苷，借助于现代科学技术可准确定量，为更全面控制紫苏子质量提供参考。

3.3 紫苏子质量标准中仅有迷迭香酸单成分分析，控制其质量专属性不强。本试验采用HPLC法同时测定紫苏子中迷迭香酸、芹菜素、木犀草苷的含量，5批样品3个成分均有检出，含量范围迷迭香酸0.257%～0.437%，芹菜素0.012%～0.082%，木犀草苷为0.024%～0.046%，该法回收率高，分离效果好，操作简便，方法可行，同时，从含量看出，紫苏子质量差异较大，本研究为标准的制定提供依据。

3.4 首次利用普通高效液相色谱仪建立紫苏子中迷迭香酸、木犀草苷、芹菜素同时测定法，5批次样品含量存在较大差异，但本方法均可对其含量进行定量控制，是完善药品标准，确保用药安全有效尤为重要的方法。