吲哚查尔酮衍生物FC58 的抗白血病多药耐药活性研究

戴佳炜，施赛健，宋瑷蔚，王志斌，庄春林，夏春年 （. 浙江工业大学药学院，浙江 杭州 004；. 海军军医大学药学院，上海 004；. 上海蒙特沃德学院）

癌症对人类是仅次于心血管疾病的第二大“杀手”，严重威胁着人类的生命健康[1]。相关统计表明，2018 年，全球新增癌症病例1 810 万，死亡病例960 万[2-3]。预计到2030 年，新增癌症病例和死亡人数将增长约1.5 倍，其防治形势十分严峻[4]。目前，治疗恶性肿瘤的方法主要有手术切除、放射疗法、生物治疗以及药物治疗等[5]。其中，药物治疗仍是肿瘤治疗的重要手段。但一半以上的癌症对传统化疗药物已产生明显耐药。临床证据显示，90%以上转移性癌症患者死于不同程度的耐药[6]，肿瘤耐药已成为目前临床化疗失败的首要原因。因此，开发多药耐药的新型抗肿瘤化疗药物已迫在眉睫。

微管蛋白抑制剂一直是抗肿瘤药物研发的热点之一[7]。微管是由α/β 微管蛋白组成的异二聚体，是细胞骨架的主要组成部分[8]。微管具有多种生物学功能，能参与细胞增殖、分裂等一系列过程[9-13]，在细胞生命周期中起重要作用，是肿瘤细胞中的重要治疗靶标。紫杉醇、长春碱等微管蛋白抑制剂已广泛用于治疗多种癌症。然而，它们显示出治疗窗窄、选择性差以及多药耐药性问题，通常是由于P 糖蛋白[14]或微管相关蛋白的过表达引起的[15]。因此，选择性好的低毒小分子靶向微管蛋白抑制剂仍有很大需求。

查尔酮衍生物是类黄酮中一类重要的化合物，分子结构简单，以1,3-二苯基丙烯酮为基本骨架，具有广泛的生物学活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血糖、抗菌等[16-19]。吲哚查尔酮是本课题组研究发现的一类新型查尔酮衍生物，相比经典的查尔酮，其抗肿瘤活性显著提高，作用机制研究表明该类化合物作用于β 微管蛋白上的秋水仙碱位点[20]，规避了P 糖蛋白调控的肿瘤多药耐药机制[21]以及β-Ⅲ型微管蛋白过表达的影响[22]，具有良好的抗肿瘤耐药活性。化合物FC58 是本课题组前期合成的查尔酮类衍生物之一，具有非常好的抗肿瘤活性（A549，GI50= 38 nmol/L）[23]。课题组以此化合物为研究对象，考察其对多种白血病细胞株的生长抑制活性，特别是耐药白血病细胞的活性，并通过细胞周期实验分析其作用特点，现报道如下。

1 仪器与试剂

全自动酶标仪（BioTek，型号：Synergy 2）；流式细胞仪（BD，型号：Accuri C6）；熔点测试仪（上海精科，型号：WRR）；核磁共振仪（Bruker，型号：Ascend 400)；高分辨质谱仪（Waters，型号：UPLC G2-XS QTOF）；薄层色谱硅胶板（烟台江友，型号：HSGF254）。实验所用试剂均为分析纯（伊诺凯）。紫杉醇、长春碱、多柔比星（Sigma-Aldrich），纯度>98%。HL60、HL60/DOX、 K562、 K562/HHT300、 CCRF-CEM、CCRF-CEM/VLB100 由海军军医大学药学院天然药物化学教研室传代和冻存。

2 实验方法

2.1 (E)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮的合成[24]

将1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙-1-酮(1, 0.21 g,1.0 mmol)与1H-吲哚-3-甲醛(2, 0.07 g, 0.5 mmol)溶于乙醇(4 ml)溶液中，加入哌啶(0.11 ml, 1.2 mmol)，加热至95 ℃搅拌48 h，然后加入盐酸调节pH = 6淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，饱和碳酸氢钠溶液、水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥、过滤、旋干有机相，剩余粗品经乙醇在−20 ℃重结晶，得到目标化合物FC58 0.017g，重结晶产率：10%，黄色固体，熔点：175.1～176.8 ℃，路线见图1。1H NMR (400MHz, CDCl3)δ: 8.71 (1H, br, NH), 8.13(1H, d,J= 15.6 Hz, =CH), 8.00 (1H, m, Ar-H), 7.63(1H, s, Ar-H), 7.55 (1H, d,J= 15.2 Hz, =CH), 7.46(1H, m, Ar-H), 7.31 (4H, m, Ar-H), 3.96 (9H, s,3×OCH3)。13C NMR (100MHz, CDCl3)δ: 189.86,153.10, 138.78, 137.23, 134.44, 130.08, 123.57,120.54, 117.82, 114.52, 111.99, 105.96, 60.97,56.40。ESI-MS (m/z) : C20H19NO4[M+H]+，理论值：338.138 7, 实际值：338.138 5。

图1 FC58 的合成路线

2.2 体外抗肿瘤活性测试[23]

样品配制：用适量DMSO（Sigma，C6295）溶解后，配成50 mmol/L 的母液备用。取一定量的母液，用完全培养基将其稀释成一定浓度的溶液，作为初浓度。将初浓度溶液用完全培养基3 倍稀释，共设置6 个浓度梯度。

CellTiter-Blue 法测试体外抗肿瘤活性。具体方法简述如下：96 孔板每孔加入浓度为(2～4)×104个/ml 的细胞悬液200 μl，置37 ℃，5% CO2培养箱内。24 h 后，加入配制好的一定浓度梯度的待测物溶液，每孔200 μl，设置3 个复孔，空白对照组加入200 μl 的含1% DMSO 的完全培养基，置于37 ℃，5% CO2的培养箱内48 h。每孔加入含10%CellTiter-Blue（Promega，G8081）的完全培养基，用全自动酶标仪测530/40 nm 和590/35 nm 处的荧光值(FV)作为背景值。置于37 ℃、5% CO2的培养箱内1～4 h，再用酶标仪在相同条件下读取荧光值。

细胞存活率（%）= 给药孔ΔFV/空白对照孔ΔFV。

根据各个浓度的细胞存活率值，使用GraphPad Prism 5 软件对数据进行拟合可得到量效曲线和抑制细胞生长50%的药物浓度，即GI50。

根据药物对非耐药母代细胞和对耐药细胞的GI50计算药物的耐药指数(DRI)。公式: DRI =GI50(耐药细胞)/GI50(母代细胞)。

2.3 细胞周期试验[23]

取对数生长的HL60 和HL60/DOX 细胞，用胰酶消化分散成单细胞悬液，以（5×105个/孔）接种于96 孔板中，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h。加入不同浓度的待测药物继续培养24 h。弃上清液，用0.25% Trypsin-EDTA（Gibco，25 200 056）消化，1 000 r/min 离心5 min 收集细胞。用1 ml 预冷的PBS（Hyclone，SH30256.FS）润洗细胞1 次，离心收集细胞。细胞沉淀用9 ml 预冷的70%乙醇轻轻混匀，4 ℃固定过夜。次日，离心沉淀细胞后，弃固定液，用1 ml 预冷的PBS 洗涤细胞2 次，再次离心收集细胞。加入1 ml PI（50 μg/ml PI, 0.1 mg/ml RNase A, 0.05 % TritonX-100，碧云天）染液染色，4 ℃下避光孵育30 min，流式细胞仪检测，激发波长为488 nm，用EXPO32 ADC 软件进行分析。

3 结果与讨论

3.1 体外抗肿瘤活性研究

课题组选择多种白血病细胞及其耐药细胞(HL60、HL60/DOX、K562、K562/HHT300、CCRFCEM、CCRF-CEM/VLB100)对紫杉醇、长春碱、多比柔星以及查尔酮衍生物FC58 进行体外抗肿瘤活性测试。结果如表1 所示，紫杉醇、长春碱和多柔比星对HL60、K562、CCRF-CEM 细胞均有较强活性，GI50在0.12～135.30 nmol/L。而各耐药细胞对上述3 种药物明显耐药，GI50在17.16～1 398 nmol/L。耐药指数DRI 在3.85～684.4。与紫杉醇、长春碱、多柔比星相比，虽然查尔酮衍生物FC58 对以上白血病细胞的活性相对较弱，GI50在30.23～44.20 nmol/L，但对耐药白血病细胞具有优异活性，GI50在17.56～51.77 nmol/L，较亲代细胞更为敏感（图2）。DRI 分别是0.40、0.90、1.71。其中，CCRFCEM/VLB100 细胞对FC58 仅轻微耐药(DRI=1.71)，远低于其他几种化疗药。

图2 FC58 对耐药和非耐药白血病细胞的GI50 值

3.2 细胞周期分析

微管蛋白抑制剂可干扰微管蛋白-微管之间的平衡，阻断有丝分裂M 期纺锤体的形成，导致有丝分裂停滞于G2/M 期，从而诱导细胞凋亡[25]。利用流式细胞技术检测FC58、多柔比星、紫杉醇和长春碱对HL60 和HL60/DOX 细胞周期的影响，考察其作用机制。

如图3 所示，与空白组相比，经1.3 倍IC50FC58 处理的组，停滞在G2/M 期的细胞明显增多。其作用强于紫杉醇，弱于长春碱。经多柔比星处理的组，停滞在S 期和G2/M 期的细胞较空白组有一定程度的增多。FC58、紫杉醇和长春碱的耐药细胞组的结果与非耐药细胞组结果基本相同。经FC58 处理的组，停滞在G2/M 期的细胞明显增多，且作用强于其余药物。多柔比星使细胞周期停滞在S 期的耐药细胞明显增多。上述结果提示，FC58 的作用靶点为微管蛋白。同时，FC58 对细胞周期的影响结果与长春碱较相似，间接证明了FC58 和长春碱作用机制相似。这可能是FC58 对CCRF-CEM/VLB100 细胞轻微耐药的原因。

图3 FC58、多柔比星、紫杉醇和长春碱作用24 h 后对HL60 和HL60/DOX 细胞周期的影响

4 结论

吲哚查尔酮类衍生物FC58 对多种白血病细胞均有较强活性，GI50达纳摩尔级。对耐药的白血病细胞同样具有较强的活性，比亲代白血病细胞更为敏感，活性抗耐药指数远强于紫杉醇、长春碱和多柔比星。FC58 和其他微管蛋白抑制剂一样都能使细胞周期停滞在G2/M 期，间接验证其作用靶点为微管蛋白。FC58 作为一个潜在的抗耐药白血病的先导化合物，有必要进一步研究其体内的抗肿瘤活性。