三倍体观赏百合与二倍体食用龙牙百合的杂交分析

崔罗敏，万 麟，周树军

(江西农业大学 林学院，南昌 330045)

百合为百合科百合属(Lilium)植物的统称，是世界范围内最重要的鲜切花之一。现代百合主要有亚洲百合(Asiatic, A)、东方百合(Oriental, O)、铁炮百合(Longiflorum, L)和喇叭百合(Trumpet, T)等组内杂交品种群；而不同种系具有不同的优点，组间杂交品种结合了两个组的优点，杂种优势突出，如：LA、OT、LO、OA等[1-3]。

LO百合是由铁炮百合与东方百合通过组间远缘杂交获得的杂交品种，一般为三倍体(2n = 3x = 36)[2]。尽管三倍体百合一般雄性不育，但作为母本可与合适的父本进行杂交获得一些非整倍体后代[4-11]。因此，利用三倍体来获得非整倍体是非常有效的方法，可以为百合新品种筛选创造更多机会。龙牙百合(L.browniivar.viridulumBaker, BB)是野百合(L.brownii)的变种，为三大食用百合之一，是江西万载地区特色经济植物，具有鳞片丰满肥厚，产量较高，品质较佳，营养丰富等优良食用品质，具有一定药用价值，同时也有一定的观赏价值[12-13]。目前关于龙牙百合的研究主要在食用、栽培、脱毒等方面[14-15]，而关于育种方面的研究相对较少[16-17]，特别是关于龙牙百合与观赏百合的杂交育种研究鲜有报道。LO百合具有植株高、花型大、香味甘甜、易繁殖等优点，利用LO观赏百合与龙牙百合杂交实现种质创新具有一定的生产意义。

本研究选择异源三倍体百合Triumphator(LLO)为母本，龙牙百合为父本，采用常规授粉和切柱头授粉的方式进行杂交，对母本及胚抢救后所得子代进行基因组荧光原位杂交(GISH)鉴定，分析母本和后代的染色体数目和组成，为培育可食可赏的百合品种提供一定的参考。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试材料有异源三倍体百合Triumphator(LLO)与龙牙百合(BB)。其中 Triumphator 为荷兰引进的品种，购自浙江虹越花卉有限公司；龙牙百合购于江西宜春市万载县百合种植户。2种百合均栽种于江西农业大学农业生态科技园大棚内并进行常规管理。

1.2 方 法

1.2.1 杂交授粉待龙牙百合刚开花时，采集其花药盛于变色硅胶干燥器中，室温保存； Triumphator于花朵开放前去雄，于2019年5月30日至6月2日采用常规授粉与切柱头授粉。常规授粉：将父本花粉均匀涂抹在母本柱头上；切柱头授粉：在距其子房约2～10 mm处，用刀片迅速切去柱头，保持切口朝上，取父本花粉蘸到柱头切口上。授粉之后立即用锡箔纸轻轻包裹柱头。常规授粉与切柱头授粉分别为13和32朵花。

1.2.2 胚抢救授粉6～8周后，果实开始变黄或变软时剪取至实验室进行胚培养[18]。培养基组成为2.2 g·L-1MS (Duchefa Biochemie，荷兰) + 60 g·L-1蔗糖 + 4 g·L-1琼脂 (Duchefa Biochemie，荷兰)(pH 5.8)。果实在超净工作台上用75%的酒精消毒后，将胚或胚乳发育不明显的胚珠直接放入培养基中，有胚乳或胚发育的胚珠剥除种皮后再放入培养基中，后放置25 ℃中进行暗培养。萌发后转入培养基[2.2 g·L-1MS + 50 g·L-1蔗糖 + 4 g·L-1琼脂(pH 5.8)]，在25 ℃下2 000 Lx的光照培养室进行培养。

1.2.3 染色体制片有丝分裂染色体制备参照Zhou等[19]的方法。取长度大约1 cm左右的百合根尖，用0.7 mmol·L-1放线菌酮(Duchefa Biochemie，荷兰)在25 ℃下处理4 h，置于卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸=3∶1，V/V)中4 ℃固定12 h以上备用。取出固定的根尖加入1%的果胶酶和纤维素酶(兰博利德，北京)混合液，在37 ℃下处理50 min左右，使其充分酶解软化。取出酶解的根置于载玻片上加1滴45%乙酸混匀，盖上盖玻片，镜检观察较好的中期分裂相用于GISH分析。

1.2.4 基因组原位杂交(GISH) GISH流程参照Xiao等[20]的方法。东方百合Sorbonne与铁炮百合White fox的基因组DNA作探针，其中东方百合基因组DNA用Biotin-11-dUTP标记(Roche，德国)，铁炮百合基因组DNA用Digoxigenin-16-dUTP标记(Roche，德国)。采用常规染色体制片，杂交混合液体积为40 μL/片，其中含有25～50 ng探针DNA，50%去离子甲酰胺(索莱宝，北京)，10%硫酸葡聚糖(索莱宝，北京)，2 × SSC(Duchefa Biochemie，荷兰)和1～3 μg封阻DNA(索莱宝，北京)。分别用Cy-3和FITC检测系统检测，用Vectashield-1200(含DAPI)(Roche，德国)封片。最后在蔡司荧光显微镜(ZEISS Scope. A1，德国)下观察并照相，每个材料选择3～5个较好的中期分裂相分析。

2 结果与分析

Triumphator与龙牙百合采用常规授粉与切柱头授粉杂交均获得发育较好的果实，结实率分别为23.08%与43.75%，平均有胚数分别为0.54、0.22(图1，表1)。表明三倍体LLO百合与龙牙百合具有较好的亲和性，常规授粉获得26株幼苗，切柱头授粉获得14株幼苗(图1，表1)。这说明LO百合Triumphator与龙牙百合杂交采用常规授粉具有更好的亲和性。

表1 Triumphator 与龙牙百合杂交结果统计

A. 杂交果实：1. 常规授粉；2. 切柱头授粉；B1. 常规授粉获得的幼苗；B2. 切柱头授粉获得的幼苗图1 杂交果实和胚抢救获得幼苗(标尺 = 1 cm)A. Hybrid fruit: 1. Normal pollination; 2. Cut style pollination; B1. The progenies from normal pollination; B2. The progenies from cut pollinationFig.1 Hybrid fruit and the seedlings from embryo rescue (Bar = 1 cm)

从不同授粉方式获得的杂交后代中各取4株发育较好的幼苗和母本进行 GISH分析(图2)。通过GISH分析来自Longiflorum (L)和Oriental (O)基因组的染色体可清楚区分，但L基因组与B基因组的染色体却难以区分，这可能由于铁炮百合与龙牙百合亲缘关系较近。亲本Triumphator为LLO异源三倍体(2n = 3x = 36)，而所有鉴定的杂交后代均为非整倍体，子代的染色体变化范围为26～32，平均为29.75条(表2)，且亲本与子代均无重组现象，其中L与B基因组染色体总共为24条。由于作父本的龙牙百合产生的花粉含有12条染色体(n = x = 12)，因此可推断出三倍体母本产生的卵细胞的染色体数目变化范围为14～20，即来自母本卵细胞的染色体组成为12条L基因组和2～8条O基因组染色体。

表2 8个杂交子代基因组成

A. Triumphator;B-E. 常规授粉后代;F-I.切柱头授粉后代;B2与F2蓝色标记为东方百合染色体；其他图中蓝色标记和绿色标记为铁炮百合与龙牙百合，粉色标记为东方百合染色体；表2幼苗编号同此图。标尺 = 10 μm图2 母本及杂交子代GISH结果A. Triumphator; B-E. Normal pollination progenies; F-I. Cut style pollination progenies; Oriental chromosomes are blue of B2 and F2; Longiflorum and L. brownii var. viridulum chromosomes are blue and green, Oriental chromosomes are pink； Table 2 seedling code are the same as this figure. Bar = 10 μmFig.2 The results of GISH of parents and progenies

3 讨 论

3.1 关于百合授粉技术

切割柱头在百合育种中较为常用，在一定程度上能够有效地克服远缘杂交中受精前障碍[17, 21]。本研究采用常规授粉和切柱头授粉均获得了发育较好的果实和一定的幼苗，但采用常规授粉获得幼苗的比例明显比采用切柱头授粉的高。有研究发现切割柱头授粉有时会降低杂交结实率，这可能是切柱头授粉后由于缺少了柱头的缓冲能力和柱头分泌液的刺激作用，降低了花粉的萌发[22]；或者可能是花粉管没有得到花柱中营养或信号的供给[23]。通常在亲缘性较近时采用常规授粉比切柱头授粉的得胚率明显更高[24]，这可能是龙牙百合与LLO三倍体中的铁炮百合基因组亲缘关系较近，采用切柱头授粉可能降低了花粉的萌发或者减少了花粉管进入花柱时的营养吸收和信号。

3.2 龙牙百合归属情况

De Jong[25]将野百合(L.brownii)划分于Archelirion组，后人研究发现野百合与Archelirion组中其他的百合亲缘关系并不紧密，因而将其划入Leocolirion组更合适[26]，而龙牙百合为野百合的变种。本试验结果得出铁炮百合的基因组与龙牙百合的基因组通过GISH分析难以区分，说明龙牙百合与铁炮百合亲缘性更近。

3.3 关于Triumphator(LLO)与龙牙百合杂交

三倍体植株一般高度不育，但这只是相对的，如百合三倍体虽然多为雄性不育，但却可以作为母本与合适的二倍体或四倍体杂交，产生的后代多为非整倍体，如AAA × AA/AAAA, LAA × AA/AAAA, OTO × OO/TT[4, 11, 27-29]。这主要是百合为贝母型植物，三倍体百合虽然减数分裂异常，但最终形成的极核基因组始终为体细胞的2倍，从而与整倍体父本杂交后形成了整倍体胚乳，整倍体的胚乳可以供养非整倍体胚的发育[4, 6-11]。

基因组荧光原位杂交(GISH)可以区分不同来源的染色体组，本试验结果发现铁炮百合的基因组与龙牙百合的基因组通过GISH分析难以区分，这也证实了龙牙百合与铁炮百合两个基因组亲缘性较近。本试验获得的杂交后代均为非整倍体，通过GISH分析表明，这些非整倍体杂交后代L与B基因组染色体总共为24条，且无重组现象，这与前人在LLO × TTTT、LLO × OTOT中的报道是一致的[30-31]。这是由于三倍体减数分裂异常，可能是LLO百合基因组中的24条L基因组染色体基本正常的联会配对，而O基因组染色体基本未正常联会配对，在后期时O基因组染色体随机分配到子细胞中。通过三倍体获得的非整倍体后代在形态性状方面可能表现出很大的差异。因此，利用三倍体来获得非整倍体是非常有效的方法，可以为选育百合新品种创造更多的机会。研究异源三倍体LO百合与龙牙百合的杂交亲和性，实现赏食兼备的百合种质创新具有较高理论和实践意义。