白术白芍祛斑霜的制备

韩美子， 姜小天， 夏婷， 张立秋， 施溯筠

(延边大学 药学院，吉林 延吉 133002)

0 引言

人体皮肤受到外界刺激或受到内分泌因素影响时会导致体内产生过量的黑色素，进而在皮肤表面形成色斑.研究显示，黑色素合成的路径主要是由酪氨酸酶催化氧化酪氨酸生成氧自由基，继而生成黑色素；因此，抑制酪氨酸酶活性、减少氧自由基的数量可显著减少黑色素的生成[1-2].古代方剂“三白汤”是一种经典的美肤方剂，具有良好的美白祛斑效果[3].该方剂主要由白术、白芍、白茯苓3种药材组成，辅药为甘草.现代药学研究表明，这4种药材都有较好的抗氧化和抑制酪氨酸酶的功效[4-7].研究表明，人参中的熊果苷可有效抑制酪氨酸酶的活性和阻断多巴及多巴醌的合成，因而对抑制黑色素的生成具有良好的作用[8-9].目前，在市场上还未发现利用上述几种中药复配制成的祛斑霜产品；为此，本文利用DPPH法和酪氨酸酶抑制实验从上述5种药材中筛选出对自由基清除率最高，且对酪氨酸酶抑制率最优的中药及其复配比例，并通过实验验证了所制备的中草药祛斑霜的有效性和安全性.

1 药材与试剂

白术、白芍、白茯苓、甘草，购于北京同仁堂延边连锁药店有限公司(北京仟草中药饮片有限公司)；人参购于吉林省延吉市西市场.DPPH，Sigma-Aldrich公司；酪氨酸酶、L-多巴(纯度≥98%)、熊果苷，上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇，沈阳市试剂三厂；甘油、卡波姆940、三乙醇胺、十八醇、硬脂酸、丙二醇、苯氧乙醇，山东优索化工科技有限公司.

高速台式离心机(Z-36HK)，天津市医疗器械厂；紫外-可见分光光度计(UV-2201)，日本岛津公司；AP-HX七英寸控湿控温试验箱，东莞市爱佩试验设备有限公司；数字皮肤水分测试仪(SK-III)，深圳凯尔电子有限公司；多功能超纯水系统(RODI)，厦门锐思捷科学仪器有限公司.

2 实验

2.1 5种药材提取液的制备

取人参、白术、白芍、白茯苓、甘草各50 g，粉碎，过1.40 mm筛，加纯化水500 mL；于80 ℃水浴加热提取2次，第1次提取2 h，第2次提取1.5 h；合并2次滤液，将滤液蒸发浓缩后冷藏备用[10-11].

2.2 药材的筛选

2.2.15种药材的DPPH自由基清除率

配制生药质量浓度为0.5 g/mL的5种药材提取液(作为样品溶液)和0.1 mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液.参照邓明玉等[12]的方法进行筛选实验.配置反应体系S、S1、S2，各体系的溶液组分如表1所示.每个体系在室温下避光反应30 min后在517 nm波长下测定各体系的吸光度，各体系均测定3次并取平均值.以无水乙醇作为空白对照.计算DPPH自由基清除率(R)的公式为：

表1 DPPH实验溶液体系的配制 mL

2.2.2白芍复配人参、白术、甘草的抗氧化活性

将白芍提取液分别同人参、白术、甘草提取液按照1∶1的体积比进行混合，并将各混合液作为待测样品.测定各混合液的吸光度，并计算各混合液的DPPH自由基清除率.

2.3 白术和白芍提取液的体外抗氧化活性

利用DPPH自由基清除实验测定白术和白芍提取液的抗氧化活性.取白术和白芍提取液，以纯化水为溶剂分别配制质量浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10、12、14、16、18、20 mg/mL的10个样品.在517 nm波长下，测定上述不同质量浓度样品的DPPH自由基清除率.

2.4 酪氨酸酶抑制率的测定及提取液用量的确定

称取白术和白芍提取液各2 g，分别置于25 mL容量瓶内；加入10 mL超纯水，振摇；继续加超纯水，将溶液配制成质量浓度为80 mg/mL的待测液.使用待测液时，按所需的质量浓度再对其稀释.配制酪氨酸酶溶液及L-多巴溶液，并参考文献[13]中的方法进行酪氨酸酶实验.分别配置3 mL甲、乙、丙、丁反应体系，各体系的溶液组分见表2.实验时，首先在30 ℃水浴中对各体系中的PBS溶液和L-多巴溶液进行温育(10 min)，然后再向其中加入样品溶液和酪氨酸酶溶液；各组分充分混合后，在475 nm波长下测定各体系的吸光度.实验中使用0.1 mg/mL的熊果苷作为阳性对照组.计算酪氨酸酶抑制率(I)的公式为：

表2 酪氨酸酶实验溶液体系的配制 mL

通过上述实验筛选出白术和白芍提取液的最佳质量浓度后，分别以1∶1、1∶2、2∶1、2∶3、3∶2、1∶4、4∶1的体积比进行复配，并再次测定其对酪氨酸酶的抑制率，以此确定这2种提取液的最佳复配比例.

2.5 祛斑霜的制备

将卡波姆940预先用纯化水溶胀，然后加入Ⅰ相的其他物质，并于70 ℃水浴中加热搅拌至完全溶解；将Ⅱ相于70 ℃水浴中加热搅拌至完全溶解后，将Ⅰ相和Ⅱ相混合并搅拌至均匀(形成的为霜剂)；将所制备的祛斑霜移至实验台，在室温下继续搅拌3 min,所得即为祛斑霜基质.在祛斑霜基质中加入适量Ⅲ相(白芍和白术的提取液)搅拌，所得即为祛斑霜成品.Ⅰ相、Ⅱ相和Ⅲ相如表6所示.

2.6 祛斑霜的感官和理化性能评价

感官评价主要根据祛斑霜的外观状态、味道、滋润性以及后期使用性对祛斑霜进行评价[11].理化评价主要通过检测祛斑霜的耐热性、耐寒性、离心稳定性以及pH值对祛斑霜进行评价[14].将霜剂分别于(40±1)℃、-10 ℃环境下放置24 h后取出，待恢复至室温后观察霜剂是否出现分层或颗粒析出等现象；取适量霜剂放入离心机，以转速3 000 r/min离心5 min，然后观察霜剂是否出现油水分离等现象；参考文献[15]中的方法测定霜剂的pH值.

2.7 祛斑霜保湿性能的测定

按文献[16]中的方法，选择8名无过敏史且无皮肤病的20～30岁的健康志愿者进行祛斑霜的保湿性能测定.测定时，将所制的祛斑霜设置为样品组，将市售护手霜(RNW乳木果护手霜)设置为对照组，将未添加提取液的祛斑霜基质作为空白组.测试前，受试者用清水洗净前手臂内侧皮肤(保证无其他化妆品残留)，并做好测量标记(3 cm×3 cm)，然后在温度为(25±1)℃和相对湿度为(40±2)%的条件下静坐30 min.样品组、对照组和空白组随机分布，试验样品量为0.1 g，区域间隔为1 cm.涂抹后立即用数字皮肤水分测试仪(SK-III)测量空白组、样品组和对照组的皮肤含水量.每组均测定7次,每次间隔30 min.测试过程中受试者不能剧烈运动和大量饮水，同时要保持情绪稳定.

3 实验结果

3.1 5种药材提取液的抗氧化活性

表3为5种药材对DPPH自由基的清除率.由表3可以看出：在0.5 g/mL质量浓度下，白芍提取液对DPPH自由基的清除率最强(76.57%)，白茯苓对DPPH自由基的清除率最弱(32.65%).故本文选取白芍提取液分别与人参、白术、甘草3种提取液按1∶1的体积比进行复配，并通过测定其抗氧化活性筛选出复配效果最优的组合.

表3 5种药材提取液对DPPH自由基的清除率

3.2 复配组合药材的抗氧化活性

复配试验结果如表4所示.由表4可以看出，白术与白勺复配时其抗氧化活性最强(80.39%)，故本文选取白术与白勺复配用于祛斑霜的制备，并进一步分析其最佳的复配比例.

表4 复配组合对DPPH自由基的清除率

3.3 体外DPPH自由基清除率的测定

白术和白芍提取液对DPPH自由基的清除率如图1所示.由图1可以看出，当白术的质量浓度为10 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率达到最大值(51.63%)；当白芍的质量浓度为14 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率达到最大值(72.01%).另外，由图1还可以看出白术和白芍提取液对DPPH自由基的清除率达到最大值后，随着二者质量浓度的升高，二者对DPPH自由基的清除率基本保持在相对平稳的状态，由此表明白术和白芍提取液具有稳定的抗氧化性.

图1 白术和白芍提取液对DPPH自由基的清除率

3.4 白术和白芍提取液对酪氨酸酶的抑制率

表5为白术和白芍提取液对酪氨酸酶的抑制率.由表5可以看出：白术和白芍提取液对酪氨酸酶的抑制率均随浓度的升高而增加；当白术、白芍的质量浓度分别为80 mg/mL时，其对酪氨酸酶的抑制率达到最高.本文未对超过80 mg/mL时的白术、白芍提取液进行测定，其原因是当白术、白芍提取液的质量浓度分别超过80 mg/mL时，其对霜剂的颜色有较大影响.

表5 白术、白芍提取液对酪氨酸酶的抑制率

图2为不同体积配比的白术、白芍提取液对酪氨酸酶的抑制率.对复配后的抑制率结果总体进行单因素方差分析显示，P<0.05，说明总体组间呈显著性差异.对各组数据间进行单因素方差分析显示，1∶2、2∶3、1∶4比例组间的P值和1∶1、2∶1、3∶2、4∶1比例组间的P值均大于0.05(呈非显著性差异)，而1∶2、2∶3、1∶4与1∶1、2∶1、3∶2、4∶1比例组间的P值则小于0.05(呈显著性差异)，由此说明不同配比的白术、白芍提取液对酪氨酸酶的抑制率具有不同影响.本文选取对酪氨酸酶抑制率最高的配比组(白术与白芍的配比为3∶2)作为霜剂的配比.

图2 不同体积配比的白术、白芍提取液对酪氨酸酶的抑制率

3.5 白术白芍祛斑霜的制备

参考文献[17-18]的方法并结合本文实验结果制备祛斑霜.祛斑霜的制备配方如表6所示.

表6 祛斑霜配方

3.6 祛斑霜的感官与理化性能评价

所制祛斑霜色泽均匀，无异味，易涂抹且无颗粒感.涂抹后，肤感水润无油腻感，无任何不良反应.稳定性实验结果显示，祛斑霜膏体未出现水分析出和分层现象.pH测定显示，祛斑霜的pH值为5.65.

3.7 保湿性能测定

受试者涂抹2种祛斑霜后其皮肤角质层水分含量随时间的变化如图3所示.由图3可以看出：在涂抹后180 min内，样品组的保湿性能总体优于对照组(RNW乳木果护手霜)，由此表明本实验制备的祛斑霜具有较好的保湿性能，且具有良好的保湿持久度.

图3 皮肤角质层的水分含量随时间的变化

4 结论

实验表明，当以白术和白芍提取液的质量浓度均为80 mg/mL，二者的生药量比为3∶2(体积比)进行复配组合时，其抗氧化性能和对酪氨酸酶的抑制率为最佳.经检测表明，本文制备的祛斑霜的感官、理化性能良好，符合中华人民共和国轻工行业标准(QB/T 2872—2017)中的相关标准，且具有较好的保湿功效.因此，本文制备的祛斑霜可作为一种良好的护肤类产品进行开发利用.