固氮施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501 同化硝酸盐代谢基因簇分布及调控研究

黄丽玲, 李耘, 王珊珊, 陆超, 杨智敏, 林敏, 燕永亮, 陈明, 张维, 王劲, 周正富, 柯秀彬, 战嵛华, 陆伟

(中国农业科学院生物技术研究所， 北京 100086)

硝酸盐是植物、真菌及许多细菌生长所需重要无机氮源。在有氧条件下将硝酸盐转化成氨的过程被称作硝酸盐同化，该过程包含三个特异性步骤：由硝酸盐转运系统完成的硝酸盐吸收，进入胞内的硝酸盐由同化硝酸盐还原酶(nitrate reductase，NR)催化硝酸盐还原成亚硝酸盐，随后由同化亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase，NiR)催化亚硝酸盐还原成氨，最终氨经谷氨酰氨合成酶(glutamine synthetase，GS)催化生成谷氨酰胺掺入到中心代谢途径。在氮循环系统中，硝酸盐同化对藻类等植物营养和生长的重要性早已通过大量研究得到认可[1-3]，由于异养细菌的主要作用通常被认为是分解和降解颗粒状有机氮而鲜少受到关注，直到近些年异养细菌硝酸盐同化研究才引起重视，例如：Rhodobactercapsulatus[4-5],Klebsiellaoxytoca[6-9],Azotobactervinelandii[10-16]和Bacillussubtilis[17-18]。

硝酸盐和亚硝酸盐均是带电分子，不能快速穿越生物膜，特别是硝酸盐(pKa=-1.3)需要转运蛋白转运，而亚硝酸盐通常被认为可以不经过特定蛋白转运而通过被动扩散形式进入细胞内[19-20]。硝酸盐转运蛋白有两种类型：一类是细胞周质结合蛋白依赖系统，通常由ATP水解提供能量，属于ABC转运蛋白家族，也被称作ATP驱动硝酸盐转运蛋白，例如K.oxytoca中的NasFED和Cyanobacteria中的NrtABCD；另一类是依赖于质子移动势的NarK家族转运，属于主要协同超家族(major facilitator superfamily,MFS)，例如A.vinelandii中的NarK和Paracoccusdenitrificans中的NasA。

硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶是硝酸盐同化的两个关键酶，均存在于细胞质内。硝酸盐还原酶都含有钼辅因子和铁-硫簇，真核生物中钼辅因子是钼-钼喋呤(Mo-MPT)，而细菌中则是钼-鸟苷二核苷酸钼喋呤(Mo-MGD)，其催化中心由钼辅因子和[4Fe-4S]簇组成[19]。电子供体在不同细菌中存在区别，在Azotobacter中是黄素氧还蛋白，而在Klebsiella 和 Bacillus中则来源于NAD(P)H还原态亚基[21]。亚硝酸盐还原酶均含有西罗血红素和铁-硫簇，在植物和蓝藻中电子供体为铁氧还蛋白，而在细菌和真菌中电子来自于NADH和/或 NADPH[22]。

PseudomonasstutzeriA1501是一株分离自水稻根际的联合固氮菌[34-36]，为适应水稻田特殊的生存环境，该菌进化出多样氮转化系统，包括固氮、反硝化、硝酸盐同化等。在水稻田淹水厌氧条件下，该菌能够利用硝酸盐作为电子受体进行反硝化反应，将硝酸盐还原为氮气并获得能量；而在非淹水有氧条件下，该菌可以通过同化作用利用硝酸盐为唯一氮源生长；同时，在水稻根际微氧条件下，该菌还可以进行固氮反应，将氮气转化成氨，供自身及植物生长。2008年，燕永亮等[37]对该菌进行了基因组测序，序列比对分析发现，该菌包含一个49个基因组成的固氮基因簇[38]，一套完整的硝酸盐呼吸系统[39]以及硝酸盐/亚硝酸盐同化基因簇。在此基础上，本研究利用生物信息学方法对这套完整的硝酸盐同化基因簇进行研究和分析，为揭示P.stutzeriA1501硝酸盐同化的调控机制奠定基础，同时进一步阐明该菌硝酸盐/亚硝酸盐同化作用,对于理解细菌环境适应机制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒及生长条件

1.2 生物信息学分析

P.stutzeriA1501基因组序列已在GenBank上登记，登录号为CP000304.1。采用NCBI中Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对，利用NCBI网站上保守结构域数据库(conserved domain Database，CDD)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi.)分析蛋白序列保守结构域。

1.3 nasT和nasR基因非极性突变株及功能回补菌株的构建

参考P.stutzeriA1501nasT和nasR序列设计引物(表1)，以基因组DNA为模板扩增nasT和nasR5’上游序列，PCR产物和pK18mob 质粒分别用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收目的片段，再分别将nasT和nasR5’上游片段连接到pK18mob载体上，连接产物转化大肠杆菌JM109，构建重组大肠杆菌JM109nasT和JM109nasR。采用三亲结合法[41]将重组质粒转入P.stutzeriA1501中，利用同源交换原理将pK18mob整合插入到P.stutzeriA1501基因组相应位置，经卡那霉素筛选及PCR检验，分别获得nasT和nasR基因非极性突变菌株A15nasT和A15nasR。

表1 nasR、nasT非极性突变株与回补株构建引物Table 1 Primers used in construction of the nasT, nasR mutants and complementary strains

利用分别带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的上下游引物扩增nasT和nasR基因，PCR产物和广宿主质粒pLAFR3分别用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收目的片段，将nasT和nasR基因连接到pLAFR3载体上构建重组质粒pLAFR3nasT和pLAFR3nasR，转化大肠杆菌JM109。采用三亲结合法[41]将重组质粒转化P.stutzeriA1501，经四环素压力筛选及PCR验证获得回补菌株Comp-A15nasT和Comp-A15nasR。

1.4 硝酸盐摄取能力测定

参考Van等[45]方法测定胞内硝酸盐含量。12 000 r·min-1离心收集菌体(先测定菌株OD600吸光值，按照三种菌株总OD600数值相同收集适量的菌体)，用预冷的磷酸缓冲液洗菌三次，再用磷酸缓冲液重悬菌体，超声破碎20 min，破碎液12 000 r·min-1离心收集上清液；0.5 mL的上清提取物中分别加入5 mL 0.55% Ca(CH3COO)2·H2O 溶于4% 氨水溶液，0.1 mL 1% MnSO4·4H2O 溶于5%乙酸溶液和0.1 g锌粉，剧烈震荡1 min，滤膜过滤反应液，收集到的滤液放置冰上；2 mL滤液加入0.5 mL 1% sulfanilamide溶于5 mol·L-1HCl溶液，混匀后测量OD540值。

1.5 RT-PCR

2 结果与分析

2.1 P. stutzeri A1501硝酸盐同化基因簇分布

基因组序列比对分析显示，P.stutzeriA1501在2 622 929～2 637 956和4 444 490～4 449 171各存在一个硝酸盐同化相关基因簇(图1)。

2.1.1基因簇1分析 基因簇1包含13个开放阅读框(ORF)，从nasS至cobA(图1)。nasSORF由1 449 bp核苷酸组成，编码482个氨基酸，其后nasTORF由627 bp核苷酸组成，编码208个氨基酸，这两个基因之间有35 bp重叠，处于一个转录单元。NasS编码蛋白同源性比对显示，该蛋白属于ABC转运子底物结合蛋白，是Ⅱ型细胞周质结合蛋白超家族中的一员，该超家族主要包含NrtA和CmpA蛋白，分别是硝酸盐和碳酸氢盐的受体结合蛋白，而NasT编码蛋白含有ANTAR (AmiR and NasR transcription antitermination regulators)结构域，其主要存在于一类转录抗终止调节蛋白中[8,12,42]。上述两个蛋白的结构和功能预测与已报道菌株的硝酸盐同化两组分调节蛋白NasS-NasT非常相似[12]，其中NasS序列与A.vinelandiiDJ NasS序列一致性为61.46%，NasT序列与A.vinelandiiDJ NasT序列一致性为78.85%，与P.denitrificansPD1222 NasS和NasT序列一致性分别为26.36%和36.84%[31]。

PST_2402、PST_2405和 PST_2408功能未知，PST_2403是个硫酯酶家族蛋白，PST_2404是1-磷酸果糖激酶家族己糖激酶，PST_2407推测为丝氨酸/苏氨酸激酶。

nasA由1 212 bp核苷酸组成，编码403个氨基酸。生物信息学分析显示该蛋白是NarK/NasA家族硝酸盐转运蛋白，属于主要协同超家族(major facilitator superfamily，MFS)转运蛋白，功能是跨膜转运硝酸盐或亚硝酸盐。

nirB由2 466 bp核苷酸组成，编码821个氨基酸，其结构类似于亚硝酸盐还原酶大亚基，属于NirB超家族蛋白[NAD(P)/FAD-dependent oxidoreductase，NirB]。nirD由330 bp核苷酸组成，编码109个氨基酸，该蛋白含有一个Rieske domain和一个 [2Fe-2S] 簇结合位点，属于NirD超家族蛋白[NAD(P)H-dependent nitrite reductase,NirD]。nasB由2 706 bp核苷酸组成，编码901个氨基酸，该蛋白含有钼喋呤二核苷酸结合结构域和[4Fe-4S]结构域，与AzotobactervinelandiiDJ菌种NasB一致性为78.60%，该酶利用单核钼辅因子催化硝酸盐还原成亚硝酸盐。cobA由840 bp核苷酸组成，编码279个氨基酸，该基因与上游基因有76个碱基的重叠，编码尿卟啉-Ⅲ C-甲基转移酶，该酶参与西罗血红素合成，而西罗血红素是亚硝酸还原酶的辅因子。

2.1.2基因簇2分析 第二个基因簇含有4个ORFs:nasR、nasF、nasE和nasD(图1)。其中nasR由1 302 bp核苷酸组成，编码433个氨基酸。该蛋白N端含有硝酸盐/亚硝酸盐感受结构域(NIT)，C端含有抗转录终止因子结构域(ANTAR)，与K.oxytocaM5a1 NasR结构相似，序列一致性为30.80%，推测其功能也是感受硝酸盐/亚硝酸盐，起抗转录终止作用，正调节下游硝酸盐同化操纵子的表达。

nasF至nasD处于同一操纵子，共同编码ABC转运家族蛋白。nasF编码细胞周质硝酸盐/亚硝酸盐结合蛋白，推测与NrtA功能类似，与K.oxytocaM5a1 NasF序列一致性为38.03%；nasE编码硝酸盐ABC转运透性酶，与NrtB功能类似，与K.oxytocaM5a1 NasE序列一致性为39.39%；nasD编码蛋白具有ATP结构域，属于ATP结合转运蛋白，与NrtC和NrtD功能类似，与K.oxytocaM5a1 NasD一致性为62.21%。

2.2 nasT、nasR突变对硝酸盐利用能力的影响

2.2.1硝酸盐同化能力分析 生物信息学分析结果显示，P.StutzeriA1501中存在两个硝酸盐同化基因簇，nasST-nasA-nirBDnasBcobA和nasR-nasFED，这样的基因簇分布方式还未见报道。已有研究结果表明，硝酸盐同化基因通常组成一个基因簇行使功能[14,17,46-48]。

从P.stutzeriA1501硝酸盐同化基因排布情况推测NasS-NasT和NasR分别调控各自下游基因的表达，为验证上述推测，分别构建了nasT和nasR基因突变株A15nasT和A15nasR，以及突变株回补菌株Comp-A15nasT和Comp-A15nasR。培养实验结果(图2)表明，nasT和nasR突变均不影响菌株在铵盐培养基中的生长，而在硝酸盐培养基中nasR突变株生长能力下降了约一半，nasT突变株则完全丧失了生长能力。

2.2.2硝酸盐转运能力分析 随后测定了A15nasT和A15nasR突变株将硝酸盐转运至胞内的能力(图3)。结果表明，nasR突变硝酸盐转运能力下降了约60%，而nasT突变对硝酸盐转运几乎没有影响。结合生长实验结果初步判定NasR调控硝酸盐转运，而NasT调控硝酸盐/亚硝酸盐还原。

2.3 硝酸盐/亚硝酸盐同化基因表达分析

为进一步明确上述结果，对两个突变株中主要硝酸盐/亚硝酸盐同化基因表达情况做了RT-qPCR分析(图4)。在A15nasR突变株中调控基因nasST和硝酸盐/亚硝酸盐还原酶基因(nirBDnasBcobA)表达没有显著变化，但是硝酸盐/亚硝酸盐转运基因(nasFED)表达显著下调；在A15nasT突变株中调控基因nasR和硝酸盐/亚硝酸盐转运基因(nasFED)表达没有显著变化，但是硝酸盐/亚硝酸盐还原酶基因(nirBDnasBcobA)表达显著下调。

上述结果表明，在P.stutzeriA1501中，NasS-NasT系统调控该菌同化硝酸盐/亚硝酸盐还原酶基因的表达，NasR调控硝酸盐/亚硝酸盐转运基因的表达，而NasS-NasT和NasR之间没有调控关系。

3 讨论

3.1 P. stutzeri A1501同化硝酸盐/亚硝酸盐相关基因命名

历史上由于对硝酸盐/亚硝酸盐代谢研究阶段及对象的不同，研究人员不可避免的对不同生物中同源基因给予了不同命名，至今也没有统一，给后续研究带来了一定的困扰。例如ABC同化硝酸盐转运包括细胞周质结合蛋白、膜蛋白和ATPase，在Cyanobacteria中上述蛋白编码基因命名为nrtA、nrtB和nrtCD，在K.oxytoca中则命名为nasF、nasE和nasD；MFS家族硝酸盐转运蛋白编码基因在P.denitrificans和B.subtilis中命名为nasA，在A.vinelandii和Methylococcuscapsulatus中命名为narK。根据基因结构、相似度以及为了区分硝酸盐呼吸系统中narK基因，本研究暂将P.stutzeriA1501中这两类转运蛋白编码基因分别命名为nasFED和nasA。

同化硝酸盐还原酶编码基因在P.denitrificans和B.subtilis中命名为nasC，在A.vinelandii和K.Pneumoniae342中命名为nasB，R.capsulatus和Haloferaxmediterranei中命名为nasA，在PseudomonasentomophilaL48中命名为narB，根据基因相似度将P.stutzeriA1501中同化硝酸盐还原酶暂命名为nasB。

同化亚硝酸盐还原酶大亚基编码基因在A.vinelandii中命名为nasA，在P.denitrificans和K.Pneumoniae342中命名为nasB，在B.subtilis和H.mediterranei中命名为nasD，在R.capsulatus和P.entomophilaL48中命名为nirB。而同化硝酸盐还原酶小亚基在R.capsulatus、A.vinelandii、P.entomophilaL48和M.capsulatus中命名为nirD，在P.denitrificans命名为nasG，在B.subtilis命名为nasE。根据基因相似度将P.stutzeriA1501中同化亚硝酸盐还原酶大、小亚基编码基因暂命名为nirB和nirD。

编码尿卟啉-Ⅲ C-甲基转移酶编码基因在R.capsulatus菌中命名为cysG；在A.vinelandii菌中命名为nasH，在B.subtilis中命名为nasF。根据序列比对结果将P.stutzeriA1501暂命名为cobA。

P.stutzeriA1501同化硝酸盐/亚硝酸盐相关基因命名之所以没有完全按照nas(nitrate assimilation)系列来命名，主要原因有两点：①学界对同化硝酸盐/亚硝酸盐还原相关基因命名比较混乱；②初步研究证明,上述基因参与了同化硝酸盐/亚硝酸盐代谢，但是其中一些基因是否同时参与该菌其他氮代谢途径还有待进一步研究。尽管在P.stutzeriA1501基因组中存在一套完整的呼吸型亚硝酸盐还原酶(NIR)编码基因[39]，但是处于同化硝酸盐/亚硝酸盐代谢基因簇内的亚硝酸盐还原酶仍有可能同时参与呼吸型亚硝酸盐还原反应。因此，本研究对P.stutzeriA1501菌同化硝酸盐/亚硝酸盐代谢相关基因命名主要基于编码蛋白的结构特征和序列相似度，不排除今后根据对其功能深入研究后修正基因命名。

3.2 P. stutzeri A1501硝酸盐同化转运系统编码基因分析

基因组序列分析表明，P.stutzeriA1501同化硝酸盐基因簇中含有两类硝酸盐/亚硝酸盐转运系统，分别依赖于质子移动势的MFS家族蛋白NarK/NasA和ATP驱动的ABC转运蛋白NasFED。当阻断nasFED基因表达时，该菌并没有完全丧失硝酸盐转运能力(降低60%)，表明该菌还有其他硝酸盐转运途径，推测是NasA蛋白，需要进一步实验证明。另外，该菌在硝酸盐反硝化系统中还存在NarK蛋白和NarM蛋白[39]。尽管目前尚不清楚氮氧化物转运机制，但已知NarK类蛋白即参与了硝酸盐的转运，也参与了亚硝酸盐的泵出[49]，有些菌株中会存在另一个NarK-like蛋白，例如E.coli中的NarU蛋白，它们的功能并不完全一致，NarU蛋白主要功能是促进亚硝酸盐泵出[50]。根据保守结构域分析,NasA和NarK、NarM均属于依赖于质子移动势类硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白，但它们的氨基酸序列一致性并不高(<20%)，由于它们处于不同转录单元，基因表达受不同蛋白调控，因此推测它们各自在不同系统中发挥作用。同化硝酸盐还原不同于异化硝酸盐还原，能力供应较容易获得，所以ATP驱动的硝酸盐/亚硝酸盐转运就成为主要方式，因此推测P.stutzeriA1501同化硝酸盐还原过程中硝酸盐/亚硝酸盐的转运主要依赖于NasFED。

3.3 P. stutzeri A1501硝酸盐同化特异性调控编码基因分析

在已报道的同化硝酸盐/亚硝酸盐系统中，途径特异性调控要么由双组分的NasS-NasT执行，要么由单一组分的NasR执行，目前还没有关于在同一个菌株中同时存在NasS-NasT和NasR的报道。本研究初步证明在P.stutzeriA1501中，NasS-NasT调控硝酸盐/亚硝酸盐还原酶编码基因的转录，NasR调控硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白编码基因的转录，推测硝酸盐/亚硝酸盐转运与还原是分开进行的。由于并未发现NasS-NasT与NasR之间具有相互调控作用，因此目前尚不清楚该菌硝酸盐/亚硝酸盐转运与还原过程的协调机制。