柴胡-钩藤配伍治疗颞叶癫痫的网络药理学和分子对接研究

卢玲，吕婷婷，黄其柳，黄小妹，宋曦，秦红玲，刁丽梅*

(1.广西中医药大学研究生院，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

颞叶癫痫是局灶性癫痫的一种常见类型，具有反复发作的特点，极易发展成药物难治性癫痫[1]。颞叶癫痫患者可伴有认知功能障碍、焦虑、抑郁等并发症，严重影响患者的工作、学习和生活质量[2]。长期使用传统的抗癫痫药物可导致衰老及认知功能障碍等。中医药治疗癫痫历史悠久，对于颞叶癫痫的辅助治疗更具有较好的疗效优势[3]。本课题组长期的临床实践发现，柴胡-钩藤配伍对颞叶癫痫的辅助治疗具有良好的效果。近几年的基础实验研究也表明，柴胡中含有的有效成分柴胡皂苷可以减低癫痫大鼠颞叶皮层、海马区P-糖蛋白的表达，从而发挥抗癫痫作用[4]。钩藤通过调控星形胶质细胞，可降低脑损伤早期的癫痫易感性，且具有神经保护作用[5]。但是，柴胡-钩藤配伍的活性成分如何作用于颞叶癫痫的作用机制尚未有相关的研究和报道。

网络药理学融合了系统生物学、分子生物学、药理学等多门学科，并以计算机网络为平台来预测药物的作用靶点、从而提高药物发现效率[6]。分子对接技术是指通过计算机软件预测药物小分子与靶点蛋白之间的结合模式和亲和力[7]。因此，本研究借助网络药理学和分子对接技术，探讨柴胡-钩藤配伍治疗颞叶癫痫的作用机制，为柴胡-钩藤配伍在神经系统疾病的应用奠定了良好的基础。

1 资料与方法

1.1 颞叶癫痫相关靶点的收集

以“Temporal Lobe Epilepsy”为关键词分别在GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)以及OMIM数据库(https：//omim.org/search/advanced/)中检索颞叶癫痫相关的靶点，并对数据进行整理去重。

1.2 中药有效成分的查找

在TCMSP数据库(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)中分别检索柴胡、钩藤的成分，并以药物筛选建议：口服生物利用度(OB)[8]≥30%，类药性(DL)[9]≥0.18为过滤条件，分别筛选得到柴胡和钩藤的有效成分。

1.3 中药作用靶点的收集

将筛选出的柴胡和钩藤的有效成分分别输入TCMSP数据库中，检索获得有效成分对应的靶点。把成分及靶点数据进行编排去重，导入到UniProt 数据库中(https：//www.uniprot.org/)，对靶点蛋白进行基因注释，获得靶点对应的Gene symbol。

1.4 柴胡-钩藤配伍治疗颞叶癫痫的靶点

将颞叶癫痫相关的靶点以及柴胡-钩藤配伍的作用靶点共同导入到venny2.1.0在线软件中(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)进行映射，得到柴胡-钩藤配伍治疗颞叶癫痫的治疗靶点。

1.5 蛋白-蛋白相互作用网络的构建

把筛选出的治疗靶点输入到STRING数据库(https：//string-db.org/)中，构建蛋白-蛋白相互作用网络(PPI网路)，以了解各个靶点蛋白之间是否存在着相互作用关系。

1.6 GO和KEGG富集分析

本研究中基因富集分析是基于R语言软件(版本：v.3.5.0)条件下进行的，其软件包clusterProfiler可以对基因集合或基因簇进行GO和KEGG富集分析和可视化[10]。将治疗靶点导入R语言软件中进行富集，并以P value<0.05且P.adjust<0.05为筛选条件，选取符合条件的前20的GO生物功能和KEGG通路。

1.7 “成分-靶点-通路-疾病”关系网络的构建

对柴胡-钩藤配伍的有效成分、颞叶癫痫的治疗靶点、以及治疗靶点富集前20条KEGG信号通路进行编排。并将编排的关系对文件导入到Cytoscape3.6.1软件中进行可视化，构建“柴胡-钩藤药对有效成分-治疗靶点-KEGG信号通路-颞叶癫痫”多维关系网络，计算网络中的节点连接度(degree值)。选取degree值最大的靶点，即柴胡-钩藤配伍治疗颞叶癫痫的核心治疗靶点。

1.8 分子对接预测

为了解柴胡-钩藤药对的有效成分与治疗靶点的结合情况，本研究通过分子对接技术将柴胡-钩藤的有效成分分别与核心治疗靶点进行分子对接。同时以颞叶癫痫常用药物卡马西平、丙戊酸钠、左乙拉西坦作为对照分析。首先在RSCB PDB数据库中检索获得核心靶点蛋白的结构信息；在PubChem数据库中查找获得柴胡-钩藤有效成分的结构信息以及卡马西平、丙戊酸钠、左乙拉西坦的结构信息；最后通过Autodock Vina实现小分子化合物与靶点蛋白的分子对接。

2 结果

2.1 颞叶癫痫相关的靶点

在GeneCards数据库检索获得2 780个颞叶癫痫的靶点，在OMIM数据库中查找得到553个颞叶癫痫靶点。对两个数据库的靶点信息进行合并，去除重复部分后共得到颞叶癫痫相关的靶点3 230个。

2.2 柴胡-钩藤药对有效成分及靶点

根据过滤条件：口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18筛选出柴胡的有效成分17种，钩藤的有效成分33种，共50种。根据药物有效成分，在TCMSP中检索共得到柴胡-钩藤药对有效成分作用的靶点200个。

2.3 柴胡-钩藤配伍治疗颞叶癫痫的靶点

将颞叶癫痫相关的3 230个靶点以及柴胡-钩藤药对有效成分作用的200个靶点导入到venny中进行映射，得到柴胡-钩藤药对治疗颞叶癫痫的靶点共116个。对这116个治疗靶点信息进行编排，结果表明：在柴胡-钩藤药对的50种有效成分中，能作用于这116个治疗靶点的有效成分有41种，部分有效成分见表1。

表1 柴胡-钩藤配伍作用于颞叶癫痫的部分有效成分基本信息

2.4 构建PPI网络

把柴胡-钩藤药对治疗颞叶癫痫的116个靶点输入STRING数据库中，构建PPI网络图。结果表明：116个柴胡-钩藤药对作用于颞叶癫痫的治疗靶点相互之间均存在直接或间接的作用关系，见图1。其中PTGS2、MAPK1、AKT1、GASP3、VEGFA等治疗靶点均在PPI网络中发挥着至关重要的作用。

2.5 GO和KEGG分析

本研究基于R语言软件中的clusterProfiler包对116个治疗靶点进行GO和KEGG富集分析，并以P value<0.05且P.adjust<0.05为筛选条件，选取符合条件的前20的GO生物功能和KEGG通路。结果表明：治疗靶点主要影响铵离子结合、儿茶酚胺结合、多巴胺结合、神经递质受体的活动、多巴胺神经递质受体活动、泛素样蛋白连接酶结合、组蛋白激酶活性、类固醇激素受体活性、激酶调节活动、细胞因子受体结合、泛素蛋白连接酶结合、核受体的活动、转录因子活性，直接配体调控序列特异性DNA结合、RNA聚合酶II转录因子结合、激活转录因子结合、神经递质结合、蛋白结合、G蛋白偶联胺受体活性、支架蛋白结合、整合素结合等生物学功能，见图2；并且主要涉及糖尿病并发症的年龄-愤怒信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、前列腺癌、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、结肠直肠癌、人类巨细胞病毒感染、内分泌的阻力、麻疹、胰腺癌、松弛素信号通路、多巴胺能神经突触、膀胱癌、eb病毒感染、VEGF信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、丙型肝炎、肺结核等信号通路，见图3。

注：灰度越深，圆形越大，则表明该靶点在PPI网络中越重要。图1 116个治疗靶点的PPI关系网络图

注：横坐标代表基因数，纵坐标代表GO条目，由上至下P值逐渐增大。图2 GO 分析柱状图

2.6 构建“成分-靶点-通路-疾病”多维关系网络

将柴胡-钩藤药对的41种有效成分、116个治疗靶点以及治疗靶点富集的前20条KEGG信号通路编排成关系对文件，导入Cytoscape软件中进行可视化分析，得到“柴胡-钩藤药对有效成分-治疗靶点-KEGG通路-颞叶癫痫”多维关系网络，见图4。计算网络中各个治疗靶点的Degree值(表2)。结果表明：柴胡-钩藤配伍治疗颞叶癫痫是通过多成分、多靶点、多通路共同起作用的。PTGS2是多维关系网络中连接度最高的靶点，且它也是PPI网络中的重要靶点。因此它可能是柴胡-钩藤药对治疗颞叶癫痫的核心靶点，在治疗机制中发挥着重要的作用。

表2 柴胡-钩藤配伍治疗颞叶癫痫的前30个靶点

2.7 分子对接预测

通过分子对接技术预测核心治疗靶点PTGS2与柴胡-钩藤药对的41种有效成分的结合情况，计算出靶点蛋白与有效成分之间的结合能，见表3。若结合能<0 kJ/mol，表明有效成分小分子与靶点蛋白可以自发地结合，亲合能<-5.0 kJ/mol，表明其结合性良好，结合能越小则分子间对接越好[11]。分子对接的结果表明：柴胡-钩藤配伍药对的41种有效成分均与核心治疗靶点PTGS2的结合性良好，且97.56%的有效成分结合性优于左乙拉西坦和丙戊酸钠。乙酸亚油醇酯与核心靶点的结合性较左乙拉西坦差，但与丙戊酸钠相似。此外，有7.31%的有效成分与核心靶点的结合性优于卡马西平，其余有效成分结合性均与卡马西平相近。综上，柴胡-钩藤配伍对颞叶癫痫的疗效显著可能是由于其有效成分与颞叶癫痫的药物靶点之间的结合性良好。

3 讨论

颞叶癫痫属于中医“痫病”“痫证”的范畴，与风、痰、瘀、毒等病理因素密切相关[12]。早在《内经》有“诸风掉眩皆属于肝，热盛动风，风胜则动”，《三因极一病证方论》曰：“夫癫痫病，皆由惊动，使脏气不平”;《医方考》言：“癫疾者，风痰之故也……风热盛于肝，则一身之筋牵掣，故令手足搐溺也”，均表明痫病的发病与肝气疏泄失常密切相关。因此，中医临床上辨治痫病注重“从肝论治”[13-15]。常治以疏肝解郁、化痰熄风，如本课题组临床上常使用的加味柴胡疏肝汤，方中柴胡功善疏肝解郁，钩藤平肝熄风止痉之效佳，二者均归肝经，配伍应用可增强治痫之力[16-19]。且既往基础研究也证实了“从肝论治”复方加味柴胡疏肝汤的抗癫痫作用[20]。但是，加味柴胡疏肝汤中柴胡-钩藤配伍抗癫痫作用机制尚未有相关的报道，因此本研究通过网络药理学及分子对接技术初步揭示柴胡-钩藤配伍对颞叶癫痫的治疗作用机制。

本研究通过网络药理学技术筛选出柴胡-钩藤配伍治疗颞叶癫痫的有效成分有41种，治疗靶点共116个；构建了“PPI网络”和“柴胡-钩藤药对有效成分-治疗靶点-KEGG通路-颞叶癫痫”多维关系网络，筛选出核心治疗靶点PTGS2。结果表明：柴胡-钩藤配伍的同一种有效成分可作用于多个治疗靶点，同一个治疗靶点亦可对应多种有效成分；同一个治疗靶点可参与多条信号通络，同一条信号通路亦可富集多个治疗靶点。因此，柴胡-钩藤配伍治疗颞叶癫痫是通过多成分、多靶点、多通路共同起作用的。116个治疗靶点之间均有直接或间接的相互作用关系，而核心靶点PTGS2在“成分-靶点-通路-疾病”关系网络和“PPI网络”中均发挥着重要的作用，它可能在柴胡-钩藤药对治疗颞叶癫痫的机制中有着重要的意义。此外，本研究通过分子对接技术预测了核心治疗靶点与柴胡-钩藤配伍有效成分的结合性。结果表明：柴胡-钩藤配伍对颞叶癫痫的疗效显著可能是由于其多种有效成分均与颞叶癫痫中的药物靶点之间的结合性良好有关。

本研究筛选的核心治疗靶点环氧合酶-2(PTGS2)是一种合成炎性介质前列腺素的酶，已被广泛报道在癫痫发作过程中被诱导，被认为是癫痫治疗的潜在神经治疗靶点[21]。研究表明，PTGS2在颞叶癫痫的急性期和慢性期表达均显著上调，而在潜伏期表达不明显，通过靶向PTGS2阻断前列腺素级联反应已被认为是干预颞叶癫痫急性发作或癫痫持续状态的一种方法[22-23]。癫痫发作后，包括白细胞介素、肿瘤坏死因子α(TNFα)、环氧合酶-2(PTGS2)等关键炎症介质的表达明显增加，可能导致脑内继发性损伤，增加癫痫反复发作的可能性。在癫痫大脑特定区域PTGS2水平的升高有助于识别癫痫引起的脑部炎症区域，因此，PTGS2抑制剂对颞叶癫痫、炎症等神经系统疾病起到治疗和干预作用[24]。综上，PTGS2与颞叶癫痫的发病及治疗密切相关。因此，PTGS2用于分子对接验证靶点与药物有效成分的结合情况具有一定的可靠性。

靶点功能分析结果表明，治疗靶点共影响了157个GO生物功能；涉及157个KEGG信号通路。治疗靶点主要影响的离子结合、儿茶酚胺结合、多巴胺结合、神经递质受体的活动、多巴胺神经递质受体活动、类固醇激素受体活性、细胞因子受体结合、神经递质结合、蛋白结合等生物学功能与文献中报道相一致，均与癫痫及颞叶癫痫等的发生发展相关[25-29]。

治疗靶点富集的KEGG信号通路中，与颞叶癫痫的发病相关的主要有IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、内分泌的阻力(Endocrine resistance)、多巴胺能神经突触(Dopaminergic synapse)、VEGF信号通路等。颞叶癫痫的发病与炎症反应密切相关，而炎性细胞因子血清白细胞介素、肿瘤坏死因子均是介导炎症发生的重要参与因素[30-31]。研究证实在颞叶癫痫患者中，血清白细胞介素的水平明显升高[25]。促炎性IL-17信号通路在药物难治性癫痫免疫组学结构中起着主导的作用[32]。促炎因子IL-17具有增加血脑屏障的通透性和神经元兴奋性的作用，其促炎作用可能与颞叶癫痫的发作有关。肿瘤坏死因子α(TNF-α)可以通过调节谷氨酸受体的运输，增加兴奋性突触的传递，从而导致包括颞叶癫痫在内的癫痫发生率升高[33]。部分癫痫患者可伴有包括甲状腺功能减退、生长减慢、体重异常、生殖和性功能障碍等在内的内分泌系统并发症，这可能与内分泌阻力有关[34]。多巴胺能系统作为脑内重要的神经调节系统，对神经元兴奋性有重要影响。研究发现颞叶癫痫患者存在着多巴胺介导的神经调节系统失衡，多巴胺在突触中的持久性可能通过降低癫痫发作的阈值，从而导致癫痫更频繁的发作[35]。血管内皮生长因子(VEGF)信号被证实是耐药性颞叶癫痫的相关介质。VEGF信号介导的脑血管重塑可能参与癫痫脑内突触神经传递的调节。此外，VEGF的产生及其受体在内皮细胞中的激活改变了血脑屏障的通透性，并可能加强神经元损伤和癫痫的发作[36-37]。综上，本研究筛选的116个治疗靶点中，其富集的主要生物学功能及信号通路与颞叶癫痫密切相关，且与文献报道大致相同。

近年的临床研究发现，对于使用卡马西平治疗无效的颞叶癫痫患者，添加左乙拉西坦可提高其疗效，且优于添加丙戊酸钠[38]。而卡马西平联合丙戊酸钠治疗颞叶癫痫可减轻药物的不良反应[39]。因此，本研究选择卡马西平、左乙拉西坦、丙戊酸钠作为对照药物，进行分子对接。结果表明：柴胡-钩藤配伍的41种有效成分均可与核心治疗靶点PTGS2结合良好，除了乙酸亚油醇酯(Linoleyl acetate)外，其余有效成分与核心靶点的结合性均优于左乙拉西坦和丙戊酸钠，且结合性优于卡马西平的有效成分有3种。这可能是柴胡-钩藤配伍联合西药治疗颞叶癫痫疗效显著的重要原因。

本研究通过网络药理学技术，初步挖掘了柴胡-钩藤配伍治疗颞叶癫痫的活性成分及成分作用的治疗靶点、靶点的相互作用关系、GO生物学功能及KEGG信号通路；构建“成分-靶点-通路-疾病”多维关系网络；揭示柴胡-钩藤配伍辅助治疗颞叶癫痫的作用机制。结果表明：柴胡-钩藤配伍的有效成分可能通过多靶点、多途径、多通路对颞叶癫痫起到治疗作用。

本研究探讨柴胡与钩藤的配伍具有理论上的创新性，也进一步拓宽了柴胡-钩藤配伍在临床中的应用，为本课题组在柴胡-钩藤配伍应用方面的深入研究奠定了良好的理论基础。