银杏内酯B对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用∗

柴丽娜 杜 蕊 张艳艳 孙莹莹 梁卫章 栾绍华 关连颖 任 亮 刘津军

（1.河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001；2.河北省冀中能源峰峰集团总医院，河北邯郸 056200）

心脏缺血再灌注损伤是急性心肌梗死溶栓后及多种心脏手术术后常见并发症，严重影响患者预后，是临床上亟待解决的难题。银杏内酯B是我国传统中药银杏叶的主要活性成分之一，既往研究发现银杏内酯B具有抗氧化、抗炎以及抑制细胞凋亡等多种药理学作用［1-3］，但关于银杏内酯B对心肌缺血再灌注损伤保护作用的文献报道尚不多见。本实验采用Langendorff灌流系统，建立大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型，以维拉帕米为阳性对照药物，研究银杏内酯B对离体心脏的保护作用并探讨其可能的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠（8周龄，220～260 g）购自河北省实验动物中心，许可证号：SCXK（冀）2013-1-003。饲养环境：23～25℃、相对湿度55%～60%，适应性饲养1周后进行实验。

1.2 试药与仪器 银杏内酯B购自美国Sigma公司（批号：33570）；维拉帕米注射液购自上海禾丰制药有限公司（批号：43170116）；TTC购自美国Sigma公司（批号：M2128）；HE试剂盒购自南京建成生物工程研究所（批号：161029）；谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司（批号：170101018、161209011、170117008）；SOD、CAT、MDA、Na+-ATP、Ca2+-ATP试剂盒购自南京建成生物工程研究所（批号：161207、161124、160916、170118、160910）；K-H 液 ：用 NaCl 20.67 g、NaHCO36.27g、KCl 1.05 g、KH2PO40.48 g、Glu⁃cose 5.99 g、MgSO4·7H2O 0.87 g、CaCl20.85 g溶解于1 L蒸馏水，调节pH=7.40（自制）。主要仪器：Langen⁃dorff离体心脏灌流系统（美国Radnoti公司）；Medlab/8C生物信号采集系统（南京美易科技有限公司）；BI-2000医用图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）；紫外-可见分光光度计（上海圣科仪器设备有限公司）；生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）。

1.3 分组与造模 将100只大鼠按随机数字表法分为正常对照组、模型组、银杏内酯B（15、30、60 mg/kg）组和维拉帕米组（阳性药物对照组），各20只。手术前2 h，银杏内酯B各剂量组和维拉帕米组分别腹腔注射相应药物，正常对照组和模型组腹腔注射0.9%氯化钠注射液。参照郭丽丽等报道的实验方法制备大鼠离体心脏缺血再灌注模型：腹腔注射20%乌拉坦麻醉后，迅速开胸，切断主动脉后取出心脏，置预冷（4℃）K-H液中，分离主动脉，釆用Langendorff法逆灌含氧K-H液（充以95% O2+5% CO2），切开左心耳并由此置入带测压导管的球囊，测压导管连接生物信号采集系统［4］。正常对照组持续以7 mL/min恒速平衡灌注K-H液（37℃）110 min，模型组、银杏内酯B各剂量组和维拉帕米组依次行7 mL/min恒速平衡灌注K-H液（37℃）20 min、停灌30 min后恢复灌注60 min，然后取材行各指标检测。

1.4 标本采集与检测 1）心肌酶（AST、LDH、CKMB）活性检测。分别取各组大鼠心脏冠脉流出液，采用生化分析法检测心肌酶AST、LDH、CK-MB活性。2）TTC染色法测定心脏组织梗死面积。每组随机选取6只大鼠离体心脏，-20℃冻存20 min，置于2% TTC溶液恒温（37℃）、避光孵育15 min，红色为正常组织、灰白色为梗死区，通过医用图像分析系统计算梗死面积百分率。3）HE染色法观察心脏组织病变。每组另随机取6只大鼠离体心脏，置4%多聚甲醛溶液固定72 h，经常规脱水、石蜡包埋、切片和脱蜡水化处理后，按照染色试剂盒操作步骤行HE染色，然后通过倒置光学显微镜观察心脏组织病变。4）血流动力学指标检测。通过连接测压导管的生物信号采集系统记录各组大鼠离体心脏组织心率（HR）、左室舒张末压（LVEDP）、左室收缩压（LVSP）、左室收缩压最大上升速率（+dP/dtmax）、左室舒张压最大下降速率（-dP/dtmin）。5）心脏组织抗氧化酶活性检测。取各组剩余的8只大鼠离体心脏组织，于4℃环境剪碎，加入适量冷裂解液后研磨匀浆，制备10%组织匀浆液，3500 r/min离心10 min取上清液，按照各检测试剂盒操作方法，通过紫外-可见分光光度计检测心脏组织中抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性，丙二醛（MDA）含量以及Na+-ATP、Ca2+-ATP活性。

2 结 果

2.1 各组心肌酶活性比较 见表1。与正常对照组比较，模型组大鼠离体心脏冠脉流出液心肌酶AST、LDH、CK-MB活性显著升高（P<0.01）；与模型组比较，银杏内酯B 30、60 mg/kg组和维拉帕米组冠脉流出液AST、LDH、CK-MB活性显著降低（P<0.05或P<0.01）。

表1 各组大鼠离体心脏冠脉流出液心肌酶活性比较（U/L±s）

表1 各组大鼠离体心脏冠脉流出液心肌酶活性比较（U/L±s）

与正常对照组比较，∗∗P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01。下同。

组别正常对照组模型组银杏内酯B 15 mg/kg组银杏内酯B 30 mg/kg组银杏内酯B 60 mg/kg组维拉帕米组n 20 20 20 20 20 20 AST 9.75±2.08 64.03±14.90**53.97±14.31 27.40±5.86△△15.77±4.21△△39.85±14.06△LDH 8.62±2.58 91.87±14.95**73.70±13.94△48.31±11.63△△26.29±8.22△△54.11±13.24△△CK-MB 679.64±75.23 1789.25±271.80**1514.17±208.16 1091.64±185.11△985.08±171.29△△1079.58±187.37△

2.2 各组心肌组织梗死面积百分率比较 见表2。与正常对照组比较，模型组大鼠离体心肌组织梗死面积百分率显著升高（P<0.01）；与模型组比较，银杏内酯B 30、60 mg/kg组和维拉帕米组心肌组织梗死百分率显著降低（P<0.05或P<0.01）。

表2 各组大鼠离体心脏梗死面积比较（%±s）

表2 各组大鼠离体心脏梗死面积比较（%±s）

组别正常对照组模型组银杏内酯B 15 mg/kg组银杏内酯B 30 mg/kg组银杏内酯B 60 mg/kg组维拉帕米组n 6 6 6 6 6 6梗死百分率0.00±0.00 41.97±5.02**38.39±5.40 31.75±5.27△22.96±4.19△△30.98±4.86△

2.3 各组心脏组织病变观察结果 见图1。正常对照组大鼠离体心脏组织细胞形态未见异常；模型组心脏组织呈现肌原纤维断裂、间隙增宽、排列紊乱，细胞空泡变性、细胞质着色不均、胞核深染等病变；较模型组，银杏内酯B 15、30、60 mg/kg组和维拉帕米2.5 mg/kg组离体心脏组织病变呈现不同程度改善，其中以60 mg/kg组效果较为显著。

图1 各组大鼠离体心脏组织形态（HE染色，200倍）

2.4 各组血流动力学指标比较 见表3。与正常对照组比较，模型组大鼠离体心脏血流动力学指标（HR、LVSP、+dP/dtmax、-dP/dtmin）显著下降而LVEDP显著升高（P<0.01）；与模型组比较，银杏内酯B 30、60 mg/kg组和维拉帕米2.5 mg/kg组HR、LVDP、+dP/dtmax、-dP/dtmin显著升高且LVEDP显著降低（P<0.05或P<0.01）。

表3 各组大鼠离体心脏血流动力学指标（±s）

表3 各组大鼠离体心脏血流动力学指标（±s）

注：1 mmHg≈0.133 kPa。

组别正常对照组模型组银杏内酯B 15 mg/kg组银杏内酯B 30 mg/kg组银杏内酯B 60 mg/kg组维拉帕米组LVSP（mmHg）86.86±9.80 61.14±9.57**63.76±9.81 72.05±9.59△78.68±10.24△△74.31±10.19△n 20 20 20 20 20 20 HR（次/min）276.85±27.41 243.08±23.79**251.03±23.68 261.15±24.31△267.69±26.08△264.98±24.10△LVEDP（mmHg）7.32±2.28 35.26±9.39**26.10±6.18 21.42±5.27△16.75±4.60△△18.65±5.03△+dP/dtmax（mmHg/s）2398.26±324.41 956.87±195.94**1045.90±213.61 1469.06±234.30△1761.83±275.17△△1692.86±219.76△△-dP/dtmin（mmHg/s）1923.85±275.70 781.90±194.16**897.42±202.76 1141.72±229.28△1493.05±243.71△△1415.98±220.15△△

2.5 各组抗氧化酶（SOD、CAT）活性及MDA含量比较见表4。与正常对照组比较，模型组大鼠离体心脏组织SOD、CAT显著降低且MDA含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，银杏内酯B 30、60 mg/kg组和维拉帕米组SOD、CAT活性显著升高（P<0.05或P<0.01），MDA含量显著降低（P<0.01）。

表4 各组大鼠离体心脏组织SOD、CAT活性及MDA含量比较（±s）

表4 各组大鼠离体心脏组织SOD、CAT活性及MDA含量比较（±s）

组别正常对照组模型组银杏内酯B 15 mg/kg组银杏内酯B 30 mg/kg组银杏内酯B 60 mg/kg组维拉帕米组n 8 8 8 8 8 8 SOD（U/mg）67.93±5.08 37.40±3.99**41.27±4.65 48.83±5.11△57.89±5.64△△49.05±5.31△CAT（U/mg）37.51±4.72 16.38±3.43**20.30±3.75 24.12±3.40△31.05±4.38△21.97±4.26 MDA（nmol/mg）3.71±0.69 9.76±1.68**8.22±1.52 6.49±1.41△△5.53±0.99△△6.78±1.20△△

2.6 各组Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力比较 见表5。与正常对照组比较，模型组大鼠离体心脏组织Na+-ATP、Ca2+-ATPase活力显著降低（P<0.01）；与模型组比较，银杏内酯B 30、60 mg/kg组和维拉帕米组Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力显著升高（P<0.05或P<0.01）。

表5 各组大鼠离体心脏Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力比较［μmoL/（mg·h）±s］

表5 各组大鼠离体心脏Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力比较［μmoL/（mg·h）±s］

组别正常对照组模型组银杏内酯B 15 mg/kg组银杏内酯B 30 mg/kg组银杏内酯B 60 mg/kg组维拉帕米组n888888 Na+-ATPase 1.68±0.76 0.75±0.19**0.84±0.28 1.50±0.37△1.93±0.65△△1.91±0.72△△Ca2+-ATPase 1.49±0.41 0.65±0.22**0.97±0.36 1.33±0.40△△1.79±0.42△△1.84±0.41△△

3 讨 论

随着高血压病、高脂血症等患病人群的扩大，冠心病以及由其所引发的急性心肌梗死发病率逐年升高，严重危害着人类的生命健康。目前，临床上冠状动脉再通、恢复血流再灌注是治疗缺血性心脏病的首选方案，但缺血再灌注损伤并发症严重影响患者预后。近年来，郭志祥等研究发现血流动力学改变、氧化应激损伤以及ATPase活性降低是心肌缺血再灌注损伤主要病理机制［5-6］，这也为研发能够有效降低缺血再灌注损伤的新型药物提供了思路。

银杏叶是我国传统中药品种，《本草纲目》和《中药志》中均有记载，其性味甘苦涩平，具有益心敛肺、化湿止泻之功效。现代药学研究发现，萜内酯类化合物为银杏叶的主要有效成分，包括银杏内酯（Ginkgolide）A、B、C、M和白果内酯，其中活性最强的即为银杏内酯B，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种生物学活性。本实验釆用Langendorff离体心脏灌流技术，模拟心肌缺血再灌注损伤模型，研究发现经银杏内酯B预处理能够有效降低离体心脏冠脉流出液AST、LDH、CK-MB活性、降低心肌组织梗死面积、抑制心肌组织病变，表明银杏内酯B能够减轻心肌组织细胞损伤、改善心功能，提示银杏内酯B对离体心脏缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

血流动力学指标正常是保证心脏功能的基础，其中HR、LVEDP、LVSP、+dP/dtmax、-dP/dtmin是衡量血流动力学的重要指标；其中，HR能够反应心脏的整体功能，LVEDP能够反映舒张期左室内压变化，LVSP反映收缩期左室内压变化，LVEDP和LVSP能够体现心肌顺应性；+dp/dtmax反映心肌收缩程度、-dp/dtmax反映心肌舒张功能，二者是评价心肌收缩性能和舒张性能的敏感指标［7-8］。心肌缺血/再灌注可降低心肌舒缩功能，表现为心排血量减少及±dp/dtmax指标降低［9］。本研究发现，经银杏内酯B预处理能够有效提高离体心脏HR、LVDP、+dP/dtmax、-dP/dtmin并降低LVEDP，提示银杏内酯B具有改善离体心脏缺血再灌注损伤后血流动力学的药理学作用。

氧化应激损伤是心脏组织缺血再灌注损伤的重要病理机制之一［10］，体内氧自由基代谢失衡是氧化应激损伤的病理基础，SOD、CAT是体内清除氧自由基的关键还原酶［11-12］，MDA为脂质过氧化反应终产物，因此SOD、CAT活性和MDA含量能够间接反应心肌组织损伤的程度［13］。本研究发现，经银杏内酯B预处理能够有效改善抗氧化酶（SOD、CAT）活性并降低MDA含量，提示银杏内酯B具有抑制离体心脏缺血再灌注后氧化应激损伤的作用。

心肌缺血再灌注将导致细胞内Na+浓度升高，促进Na+-Ca2+交换而导致大量Ca2+内流而致细胞内Ca2+超载［14］，进而引起细胞结构损伤而致细胞死亡，是心脏组织缺血再灌注损伤的另一重要病理机制［15-17］。本实验研究发现，经银杏内酯B预处理能够有效提高Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活性，从而有效缓解细胞内Na+、Ca2+超载，这可能是银杏内酯B对离体心脏缺血再灌注损伤能够起到一定保护作用的机制之一。

总之，银杏内酯B能够减轻心肌组织细胞损伤、改善心功能，提示银杏内酯B对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，可能与其能够改善血流动力学、抑制氧化应激损伤以及改善Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活性有关。