肉豆蔻饮片及其标准汤剂中挥发性成分差异分析

★ 杨晓东 何广铭 彭娇 曾荟 潘晓君 谭梓君 陶晨璐 黄小丹（广东一方制药有限公司，广东省中药配方颗粒企业重点实验室 广东 佛山 528244）

肉豆蔻为肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragransHoutt.的干燥种仁。具有温中行气、涩肠止泻的功效；用于脾胃虚寒、久泻不止、脘腹胀痛、食少呕吐［1］。肉豆蔻含有丰富的挥发油、脂肪油、苯丙素、木质素等多种化学成分。挥发油是其主要的药效部位，具有较强的抑菌、抗氧化作用［2-3］。

中药挥发性成分在临床疗效中发挥着重要的作用。目前，含挥发性成分中药配方颗粒生产中一般先提取其中挥发油成分，β-环糊精包合干燥后，加入喷干粉中混匀后干法制粒，但挥发油的加入量尚未明确规定，不同企业之间挥发油加入量差别较大，有文献［4-5］报道中药饮片与对应的标准汤剂挥发油在化学成分与相对百分含量差异很大，因此本文对肉豆蔻饮片与标准汤剂挥发油进行研究，测量饮片与标准汤剂中挥发性成分的含量，并用气相色谱质谱联用对其化学成分进行分析，比较两者之间的差异，可为肉豆蔻配方颗粒生产工艺改进提供一定的参考价值。

1 仪器与材料

安捷伦8890/7000D型气相-质谱联用仪（安捷伦科技有限公司）；HP-5MS毛细管色谱柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）；移液枪（德国普兰德公司）；JJ600型电子天平（常德市双杰测试仪器厂）；陶瓷保健壶（3L，深圳一枚王有限公司）；挥发油提取装置。

本实验共收集15批肉豆蔻饮片，经广东一方制药有限公司质量中心鉴定，均为肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragransHoutt.的干燥种仁，编号为S1～S15；肉豆蔻标准汤剂（实验室自制）；乙醚（分析纯，广州化学试剂厂）。

2 方法与结果

2.1 挥发油提取及测定饮片挥发油提取：取肉豆蔻饮片粗粉约20 g，置于1 000 mL的圆底烧瓶中，加水500 mL与沸石数粒，按《中国药典》2015年版挥发油测定法（通则2204）测定。

标准汤剂挥发油提取：按《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》(征求意见稿)规定，取100 g饮片，捣碎，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，浸泡30 min，武火煮沸后文火保持微沸20 min，趁热过滤后迅速冷却。第二次加6倍量水，武火煮沸后文火保持微沸15 min，趁热过滤后滤液冷却，合并两次滤液，制得标准汤剂。将标准汤剂转移置2 000 mL圆底烧瓶中，加沸石数粒，按《中国药典》2015年版挥发油测定法（通则2204）测定。

2.2 工艺稳定性验证取同一批肉豆蔻饮片样品（S1），按2.1项下肉豆蔻标准汤剂制备方法平行制备3份标准汤剂试样并测定其中挥发油含量，计算转移率。3次试验中标准汤剂挥发油平均含量为0.439 %，RSD为7.29 %；平均转移率为6.27 %，RSD为7.29 %。以上指标结果表明该工艺具有较好的稳定性。

2.3 挥发油测定结果取15批饮片及标准汤剂样品分别按照“2.1”项下方法提取并测定挥发油，计算饮片、标准汤剂挥发油含量与转移率［挥发油转移率（%）=标准汤剂挥发油含量（%，以饮片计）/饮片挥发油含量（%）×100］，结果见表1。

表1 工艺稳定性验证

由表2可知，15批肉豆蔻饮片挥发油含量均大于6.0 %，符合《中国药典》2015版肉豆蔻挥发油项下“本品挥发油不得少于6.0 %”规定。15批肉豆蔻标准汤剂挥发油含量在0.324 %～0.670 %范围内，其转移率为5.06 %～10.00 %。上述结果显示，饮片中挥发油在煎煮过程中能部分转移到标准汤剂中，可为肉豆蔻配方颗粒生产中其挥发油的加入量提供参考。

表2 肉豆蔻饮片、标准汤剂挥发油测定

2.4 饮片与标准汤剂挥发油GC-MS对比分析

2.4.1 供试品溶液制备精密量取挥发油50 μL，置10 mL量瓶中，加乙醚溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.4.2 气相色谱条件色谱柱为HP-5MS毛细管色谱柱（柱长为30 m，内径为0.25 mm，膜厚度为0.25 μm），程序升温：初始温度40 ℃，以每分钟13 ℃的速率升温至53 ℃，保持2 min，以每分钟2 ℃的速率升温至54 ℃，以每分钟1 ℃的速率升温至57 ℃，保持2 min，以每分钟1 ℃的速率升温至60 ℃，以每分钟5℃的速率升温至220 ℃；进样量为1 μL；进样口温度为250 ℃；载气为高纯氦气（99.999 %）；载气流速为1.0 mL/min；不分流；溶剂延时3 min。

2.4.3 质谱条件离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；进样口温度为250 ℃；质荷比范围35～550 m/z，扫描方式为全扫描。

2.4.4 测定方法及结果分别取15批肉豆蔻饮片与标准汤剂挥发油，按“2.2.1”项下供试品溶液制备方法制备样品，按“2.2.2”项下气相色谱条件与“2.2.3”项下质谱条件进行测定，按峰面积归一化法计算各组分的相对百分含量。并通过NIST谱库对化学成分进行检索鉴定，肉豆蔻饮片及肉豆蔻标准汤剂均鉴定出32个化合物。结果见图1-2和表3。

图1 肉豆蔻饮片与标准汤剂挥发油总离子流图

表3 肉豆蔻饮片与标准汤剂挥发油化学成分鉴定结果

由表3可知，从肉豆蔻饮片挥发油中共鉴定出32个挥发性成分,其主要成分为肉豆蔻醚（16.22 %）、 α-蒎烯（13.09 %）、伪柠檬烯（6.5 %）、（-）-4-萜品醇（5.61 %）、γ-松油烯（4.81 %）、黄樟素（4.69 %）、甲基丁香酚（3.77 %）、松油烯（3.58 %）、榄香素（3.45 %）。上述9种化合物的含量占饮片挥发油总量的61.72 %。肉豆蔻标准汤剂挥发油中同样鉴定出32个挥发性成分，其主要成分为肉豆蔻醚（22.8 %）、α-蒎烯（7.35 %）、伪柠檬烯（4.2 %）、（-）-4-萜品醇（4.86 %）、γ-松油烯（3.87 %）、黄樟素（3.91 %）、甲基丁香酚（5.26 %）、松油烯（2.91 %）、榄香素（6.30 %）。上述9种化合物的含量占标准汤剂挥发油总量的61.46 %。

图2 肉豆蔻饮片及标准汤剂挥发油化学成分组成

3 分析与讨论

3.1 挥发油测定结果分析《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》（征求意见稿）提出中药配方颗粒研究应以标准汤剂为对照，药效物质应与标准汤剂保持基本一致且标准汤剂中有效成分含量的转移率可接受的范围为均值加减3倍SD。通过对15批肉豆蔻饮片及其标准汤剂挥发油含量进行测定发现，15批肉豆蔻饮片挥发油含量范围为6.3 %～9.7 %，15批肉豆蔻饮片标准汤剂挥发油含量范围为0.324 %～0.688 %，挥发油含量转移率范围为5.06 %～10.00 %，平均转移率为7.23 %，SD为1.5 %，X±2SD为4.38 %～10.04 %。15批肉豆蔻挥发油含量转移率均在X±2SD范围内。本研究确定了肉豆蔻标准汤剂挥发油含量及转移率范围，可为肉豆蔻配方颗粒的质量控制提供参考。

3.2 实验研究中分别对分流比、升温速率进行优化当采用分流比（10∶1）、（20∶1）时，饮片挥发油离子流图部分峰面积过小，响应较低。当提高升温速率时，部分色谱峰重叠，分离效果较差。最终采用“2.4.2”项下气相色谱条件进行样品测定，所得总离子流图分离效果好且色谱峰响应适中。

3.3 气相质谱结果分析肉豆蔻饮片与标准汤剂挥发油中共鉴定出32个共有成分，肉豆蔻饮片与标准汤剂挥发油中含量最高的均为肉豆蔻醚，其含量分别为16.22 %，22.8 %。肉豆蔻醚具有一定的毒性，服用过量对胃肠道有抑制作用，甚至可致中毒，产生昏迷及惊厥［6］。因此，应研究控制肉豆蔻饮片与标准汤剂挥发油中肉豆蔻醚的含量提高肉豆蔻配方颗粒临床应用的安全性。肉豆蔻的主治功能为温中行气、涩肠止泻［1］。挥发油中的α-蒎烯、甲基丁香酚是涩肠止泻的主要活性成分。α-蒎烯具有较强的祛痰、抑菌、消炎与止咳作用［7］，其在饮片挥发油中的相对含量为13.09 %，在标准汤剂挥发油中的相对含量为7.35 %。饮片挥发油中α-蒎烯的相对含量略高于标准汤剂挥发油中的相对含量，可能原因为肉豆蔻在煎煮过程中，部分成分挥发所致。甲基丁香酚在抑菌、止泻、清除氧自由基方面有重要作用［8-9］，饮片中甲基丁香酚的相对含量为3.77 %，标准汤剂挥发油中的相对含量为5.26 %，相对含量差异不明显。

本文对肉豆蔻饮片与标准汤剂中挥发油进行定量与定性研究，发现两者的组成成分与相对含量基本相同，该研究结果为肉豆蔻配方颗粒制备过程中有效保留挥发性成分提供参考。