芬太尼类新精神活性物质的介质阻挡放电电离质谱特征研究

尚宇瀚，洪欢欢，郭项雨，白 桦，闻路红，马 强

(1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.宁波大学高等技术研究院，浙江 宁波 315211)

芬太尼是一类作用于中枢神经系统中μ-阿片受体的脂溶性合成精神活性物质，在医学上常用于镇痛和麻醉。动物实验表明，芬太尼的镇痛效果是吗啡的80～100倍[1-2]，由于其具有强大的类阿片特性，常被滥用于医疗以外的场景。据美国缉毒局介绍，芬太尼通常被添加到海洛因中以增加其效力，或被伪装成高效力海洛因。许多吸食者在不知情下过量吸食芬太尼，最终导致死亡[3]。近年来，芬太尼的消耗量不断攀升，滥用致死事件也越来越多，已引发全球关注[4-6]。美国食品药品监督管理局、加拿大卫生部等监管机构多次发布芬太尼安全性公告及警示信息[7]，我国公安部、国家卫生计生委、国家食品药品监督管理局、国家禁毒办公室联合发布了《非药用类麻醉药品和精神药品列管办法》，将芬太尼类化合物整类列入管制[8]。

芬太尼的分子结构来源于吗啡，其合成方法由Janssen首次报道[9]。在过去的几十年中，以此为基础，大量合成了多种新型芬太尼类化合物，其药效与芬太尼相似甚至更强。虽然这些新型芬太尼类化合物的结构复杂且不尽相同，但都具有相似的骨架结构，示于图1。目前，设计新型芬太尼类化合物主要有以下几种方式：1) 在R1选择位阻较小的取代基或H原子；2) 在R2引入推电子基团；3) 在R3和R4的一处或多处引入吸电子基团；4) 在R5引入位阻较大的取代基[10]。芬太尼类化合物的合成工艺简单、原料易得，对人员和设备要求较低，导致其更新换代迅速。这对执法部门的监管水平和检测技术提出了更高要求。

图1 芬太尼类化合物的分子结构Fig.1 Chemical structures of fentanyl analogues

芬太尼类化合物的检测方法主要有气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法[11-14]。虽然色谱-质谱联用法在检测通量、灵敏度和准确性上具有较大优势，但对仪器工作环境要求较高，样品前处理过程复杂而耗时，不能满足一线执法人员现场快速检测的需求。原位电离质谱(ambient ionization mass spectrometry, AIMS)[15]具有无需或者仅需简单的样品前处理、分析速度快、绿色环保等优势，已被应用于芬太尼类化合物检测中，并取得了理想的效果。例如，Poklis等[16]采用实时直接分析(direct analysis in real time, DART)技术检测200种药品配方中17种常见药物，对芬太尼的检出限可达0.01 mg/L。Sisco等[17-19]将实时直接分析质谱法应用于法医学检测中，建立了芬太尼类化合物的现场快检方法，并评估了法医实验室环境中芬太尼类化合物的残留情况。

介质阻挡放电电离(dielectric barrier discharge ionization, DBDI)[20]是一种新型常压敞开式电离源[21]，其原理是通过使用直流电电离载气产生的等离子体探针电离样品。介质阻挡放电电离源的结构简单、工作稳定，所需电压和能量均低于常用的原位电离方法，已被应用于食品安全、公共安全、生命科学、环境监测等领域。本研究拟采用介质阻挡放电电离质谱法检测46种芬太尼类化合物，并基于二级质谱数据归纳特征性碎裂规律，希望为执法人员进行已知芬太尼类化合物的快速检测和潜在未知芬太尼类化合物的非靶向筛查提供技术参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

AmaZon Speed型离子阱质谱仪：德国Bruker Daltonics公司产品，配有电喷雾电离源、注射泵、Trap Control 7.0仪器控制软件以及Data Analysis 4.2数据处理系统；DBDI-100型介质阻挡放电电离源：宁波华仪宁创智能科技有限公司产品，配有毛细管托架与固体样品平台；Milli-Q Integral 5超纯水机：德国Merck Millipore公司产品。

1.2 主要材料与试剂

46种芬太尼类化合物标准样品(纯度均大于99%)：上海原思标物科技有限公司产品；空白药片样品(Melatonin Plus)：美国Schiff Nutrition Group公司产品；氦气(纯度99.999 9%)：北京北氧气体有限公司产品；甲醇(色谱纯)、甲酸(质谱级)：美国Fisher公司产品；硼硅酸盐玻璃毛细管(长10 cm，内径0.86 mm)：美国Sutter instrument公司产品。

1.3 实验条件

1.3.1电喷雾电离分析条件 正离子模式，毛细管电压3 000 V，基板电压500 V，雾化气压力4.8×104Pa，干燥气流速5 L/min，温度180 ℃，注射泵进样速率5 μL/min。

1.3.2介质阻挡放电电离分析条件 正离子模式，毛细管电压1 000 V，基板电压500 V，源内温度160 ℃，载气流速2 L/min，电离源出口与锥孔夹角180°，样品距锥孔0.5 cm，电离源出口距样品0.5 cm，进样量2 μL，芬太尼类化合物标准溶液通过定量移液器滴加到硼硅酸盐玻璃毛细管末端，毛细管末端与介质阻挡放电电离源产生的等离子体边缘相切。

1.3.3介质阻挡放电电离源分析粉末样品条件 正离子模式，毛细管电压1 250 V，基板电压500 V，源内温度220 ℃，载气流速4 L/min，电离源与锥孔夹角135°，样品距锥孔2.5 cm，电离源距样品1 cm，用直径6 mm的圆形双面胶带将0.5 mg粉末样品粘于载玻片表面，介质阻挡放电电离源产生的等离子体直接指向样品表面进行离子化[22]。

2 结果与讨论

2.1 离子化方式的考察

通常情况下，质谱图中的碎片离子越多，提供的信息越丰富，越有利于分析目标物质的碎裂行为。本实验考察了ESI和DBDI两种离子化方式对芬太尼类化合物二级质谱碎片离子数量和强度的影响。以芬太尼和对氟芬太尼为代表，按1.3.1和1.3.2节条件采集二级质谱数据并进行对比分析，结果示于图2。使用DBDI与ESI检测芬太尼所得的二级质谱图示于图2a。这两种方式所得的质谱图中均可观察到准分子离子峰[M+H]+(m/z337)与碎片离子峰[M+H-C9H10NO]+(m/z188)。此外，由哌啶环4号位连接的官能团碎裂产生的[M+H-C3H5O]+(m/z281)和[M+H-C8H10O]+(m/z216)碎片离子[23]也可在两种电离方式获得的谱图中观察到。在DBDI下可以观察到[M+H-H2O]+(m/z319)碎片离子，而在ESI谱图中没有，这可能是由芬太尼分子在等离子体作用下脱水产生的。使用两种离子源采集对氟芬太尼的二级质谱图示于图2b。相比之下，DBDI质谱图中的碎片信息更丰富，除了准分子离子峰(m/z355)、哌啶4号位基团碎裂产生的碎片峰(m/z299、188)和哌啶环碎裂产生的[M+H-C8H10N]+(m/z234)外，还可观察到m/z337脱水峰，以及可能由氟代苯基碎裂产生的碎片离子m/z285、269。

图2 芬太尼(a)和对氟芬太尼(b)的介质阻挡放电电离与电喷雾电离质谱图Fig.2 DBDI and ESI mass spectra of fentanyl (a) and p-fluorofentanyl (b)

可以看出，使用两种离子化方式采集的芬太尼类化合物二级质谱图主要质谱碎片信息基本一致。ESI方式下所得的碎片离子信号强度略高于DBDI，而DBDI可得到更多的碎片离子。这是由于DBDI通过电离载气氦气形成低温等离子体，在进行质谱分析时，待测物、载气和空气的电离产物均会在电场作用下进入离子阱，在碰撞诱导解离过程中，待测物与电离气体发生碰撞，从而产生比电喷雾电离种类更多的碎片离子。因此，采用DBDI更利于解析目标化合物的碎裂模式。

2.2 介质阻挡放电电离质谱法分析芬太尼类化合物的碎裂模式

以DBDI为离子化方式，分别调节不同的碎裂电压进行碰撞诱导解离，获得了46种芬太尼类化合物的二级质谱图、质谱数据及碎裂电压，基于化合物分子结构与二级质谱碎片离子信息归纳碎裂模式。芬太尼类化合物大多是以取代基取代芬太尼上原有官能团而制备的，因此芬太尼及其前体化合物的质谱碎片特征可为总结芬太尼类化合物的裂解规律提供重要参考。芬太尼及其合成过程中常用原料N-苯乙基-4-哌啶酮和4-苯胺基-N-苯乙基哌啶的二级质谱碎片离子列于表1(序号1～3)。N-苯乙基-4-哌啶酮的主要特征碎片离子为m/z105，推测是由N-苯乙基-4-哌啶酮结构中苯乙基与哌啶环之间的C—N键发生断裂所致。4-苯胺基-N-苯乙基哌啶的主要特征碎片离子为m/z188，推测是4-苯胺基-N-苯乙基哌啶分子结构中哌啶环与苯胺基之间的C—N键发生断裂而形成的碎片离子。芬太尼的断键位置和碎片离子示于图3。芬太尼的裂解规律与两种前体化合物相似，均可形成m/z188、105特征碎片离子，碎片离子m/z216则是由哌啶环内部的C—N键发生断裂而产生。此外，m/z188碎片伴随质量数为149 u的特征中性丢失。

图3 芬太尼可能的质谱裂解途径Fig.3 Proposed mass spectrometric fragmentation pattern of fentanyl

当芬太尼发生取代反应时，根据取代反应发生位置的不同会产生不同的碎片离子，但其主要断裂规律不会发生改变，可分为两类。1) 取代反应发生在哌啶环和与哌啶N相连的苯乙基上，无论是单取代还是多取代反应，这类化合物在碰撞诱导解离过程中均发生149 u的中性丢失，对应的中性丢失碎片为N-苯丙酰胺(表1，序号4～16)。其他碎片离子的结构类似于4-苯胺基-N-苯乙基哌啶，具体取决于取代基类型。以β-羟基芬太尼和顺-3-甲基芬太尼为例，当羟基的取代反应发生在苯乙基时，质子化的β-羟基芬太尼在碰撞诱导解离作用下失去羟基，产生m/z204特征碎片离子和质量数为149 u的中性丢失碎片，示于图4a；当甲基的取代反应发生在哌啶环上3号位时，其特征碎片离子为m/z202，同时产生质量数为149 u的中性丢失碎片，示于图4b。类似地，当取代反应发生在哌啶环上4号位时(表1，序号10)，该位置的空间位阻增大，稳定程度降低。此时，只需使用较低的碰撞能量就可以发生解离，失去4号位取代基，继而产生相应的碎片离子。此后的碎裂模式与2号或3号位发生取代的芬太尼化合物类似，并会产生149 u的中性丢失碎片。2) 取代发生在N-苯丙酰胺基上时，无论是单取代还是多取代反应，这类芬太尼化合物在碰撞诱导解离过程中连接在哌啶环4号位的所有基团都会丢失，最终得到4-苯胺基-N-苯乙基哌啶特征碎片离子m/z188(表2，序号1～30)。以对氟芬太尼和呋喃芬太尼为例，当N-苯丙酰胺基中的N-苯基发生氟原子取代时，其前体离子为m/z355，经碰撞诱导解离后获得的主要特征碎片离子为m/z188，示于图5a；当N-苯丙酰胺基中的N-酰基发生呋喃取代时，经碰撞诱导解离后获得的主要特征碎片离子同样为m/z188，示于图5b。

图5 对氟芬太尼(a)和呋喃芬太尼(b)可能的质谱裂解途径Fig.5 Proposed mass spectrometric fragmentation patterns of p-fluorofentanyl (a) and furanylfentanyl (b)

图4 β-羟基芬太尼(a)和顺-3-甲基芬太尼(b)可能的质谱裂解途径Fig.4 Proposed mass spectrometric fragmentation patterns of β-hydroxyfentanyl (a) and cis-3-methylfentanyl (b)

表1 具有质量数为149 u中性碎片丢失的芬太尼类化合物Table 1 Fentanyl analogues with neutral loss of 149 u

2.3 粉末样品中芬太尼的测定

向空白药品粉末中添加不同浓度的芬太尼，制备不同含量的空白添加样品。分别以m/z337>188和m/z337>216作为定量离子对和定性离子对，设定采集时间30 s，按1.3.3节条件测定，所得选择离子监测色谱图示于图6a。以信噪比3和10计算芬太尼的检出限和定量限分别为0.5、1 mg/kg。以峰强度为纵坐标(y)，质量浓度为横坐标(x)，在1～20 mg/kg浓度范围内进行线性回归，得到校准曲线y=315.12x-54.94(r=0.999 3)，示于图6b。制备质量浓度为5 mg/kg 的芬太尼空白添加粉末样品，按照本方法进行测定，重复3次，测得其含量为4.96 mg/kg，相对标准偏差为2.6%。

注：a.选择离子监测色谱图；b.校准曲线图6 介质阻挡放电电离质谱法分析固体粉末样品中的芬太尼Fig.6 Analysis of fentanyl in solid powder samples using DBDI-MS

3 结论

本研究采用介质阻挡放电电离质谱法采集了46种芬太尼类化合物的二级质谱数据，并归纳了质谱裂解规律，同时建立了粉末样品中芬太尼的快速测定方法。通过对碎裂模式的总结与分类，有助于非靶向筛查潜在未知芬太尼类化合物，本方法可实现粉末样品中芬太尼类化合物的快速定性定量分析。