不同尿素添加剂量对蒸汽爆破玉米秸秆体外瘤胃发酵和功能微生物数量的影响

孙美杰 徐诣轩 曹玉荣 杜风光 申军士* 朱伟云

(1.南京农业大学,国家动物消化道营养国际联合研究中心，江苏省消化道营养与动物健康重点实验室，消化道微生物研究室，南京 210095；2.易高卓新节能技术(上海)有限公司，上海 201109)

玉米秸秆是我国最丰富的农作物副产品[1-2]，低廉的价格使其成为反刍动物秸秆饲料、纤维素乙醇生产和生物沼气生产的丰富原料[3-6]。玉米秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，彼此通过化学键紧密连接，这种复杂的理化结构严重阻碍了玉米秸秆的利用。因此，对玉米秸秆进行预处理是克服木质纤维素难分解的有效策略之一，也是现今使用最为广泛的措施之一。蒸汽爆破是一种有效提高秸秆营养价值的物理处理方法[7]，经高温高压饱和蒸汽作用，秸秆中的半纤维素水解成可溶性单糖，木质素部分破裂重新排列，暴露出纤维素。经过蒸汽爆破处理，不仅提高了秸秆的柔软性，而且提高了秸秆的比表面积，可促进消化道微生物黏附和有关酶的识别结合，提高秸秆利用效率[8]。因此，蒸汽爆破被认为是21世纪解决秸秆饲料化的潜在技术之一，其相关技术的完善、在动物体外和体内试验上的应用效果以及相关代谢机理成为今后研究的重点。

蒸汽爆破虽然能够促进秸秆纤维素、半纤维素的降解，但是却不能解决秸秆本身蛋白质含量低的问题，能氮的不平衡性还是不利于反刍动物对秸秆的高效利用。有研究发现，向饲喂蒸汽爆破玉米秸秆的绵羊饲粮中添加尿素可使瘤胃中可溶性糖含量明显增加，并显著增加了纤维素和半纤维素的可消化部分[9]，并且还能使蛋白质含量提高2倍多[10]。Hai等[10]对经过蒸汽爆破并且添加2%尿素(干物质基础)的小麦秸秆进行体外发酵试验后发现，绵羊对蒸汽爆破小麦秸秆的干物质消失率(DMD)以及中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤木质素(ADL)和纤维素的消化利用率显著提高。此外，尿素水解产生的氨也为瘤胃微生物提供了充足的氮源[11]。有研究表明，瘤胃微生物对氮源的需求有50%～80%是以氨的形式被满足，剩下20%～50%是以肽和氨基酸的形式被满足[12]，并且瘤胃中绝大部分纤维降解细菌将氨作为其生长的主要氮源。但是，反刍动物对尿素氨的利用情况与尿素添加量存在直接关系。Kertz[13]报道，当以干物质消失率和非氨态氮(NH3-N)流量为测定指标时，瘤胃氨的最佳浓度在17～25 mg/dL。过量的氨会打破瘤胃内氮的平衡，增加反刍动物氨中毒的风险[14]。但在尿素诱导的高氨浓度条件下，瘤胃微生物对秸秆的利用是否会受影响，以及秸秆经蒸汽爆破处理后是否可以进一步增强瘤胃微生物对NH3-N的吸收和利用等问题仍有待进一步的探究。因此，本试验通过静态模拟瘤胃体外发酵法，探究尿素添加诱导的不同氨浓度对蒸汽爆破玉米秸秆发酵的影响，以期为促进蒸汽爆破玉米秸秆的饲料化应用提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米秸秆：将收集的玉米秸秆样品平均分成两部分，其中一部分不做任何处理，作为未处理玉米秸秆；另一部分在蒸汽爆炸反应器(河南天冠企业集团有限公司自行研制开发)中爆破，制成蒸汽爆破玉米秸秆。蒸汽爆破处理条件为50 L容量罐，两段变压汽爆，0.7 MPa、8 min与1.2 MPa、2 min，由河南天冠企业集团有限公司制作完成。将2种玉米秸秆样品在65 ℃下烘干粉碎，过40目筛，于4 ℃冰箱中储存备用。

添加剂：尿素，纯度≥99.5%。

1.2 试验设计

采用2×3双因素试验设计，即2种玉米秸秆底物[未处理玉米秸秆(C)与蒸汽爆破玉米秸秆(S)]和3个尿素添加剂量(0、20、100 mg/dL)，共6个处理(C-0、C-20、C-100分别为未处理玉米秸秆中添加0、20、100 mg/dL尿素，S-0、S-20、S-100分别为蒸汽爆破玉米秸秆中添加0、20、100 mg/dL尿素)，每个处理5个重复，采用湖羊作为瘤胃液供体，进行体外发酵。

1.3 玉米秸秆的常规养分含量测定

参照AOAC(1995)[15]方法对饲料样品进行干物质(DM)、粗灰分(Ash)和粗蛋白质(CP)含量分析。参照Van Soest等[16]描述的方法，使用A220纤维分析仪(ANKOM Technology Corporation，美国)测定饲料样品中NDF和酸性洗涤纤维(ADF)含量，根据NDF与ADF含量计算半纤维素和中性洗涤可溶物(NDS)含量。

1.4 瘤胃液接种与体外发酵

瘤胃液采自南京农业大学动物房3只健康并装有瘤胃瘘管的公湖羊，体重(30±2) kg，采食的饲粮为全混合日粮[25%玉米青贮、20%花生藤、42%玉米、4%豆粕、4%麸皮、5%预混料(每千克预混料含有：氯化钠150 g，碳酸氢钠200 g，钙75 g，磷20 g，锰600 mg，铁680 mg，锌960 mg，铜300 mg，维生素A 140 000 IU，维生素D355 000 IU，维生素E 700 IU，烟酸600 mg)]。每日08:00和17:00各饲喂1次，自由饮水。试验当天晨饲前通过瘤胃瘘管收集瘤胃液，保存在39 ℃预热并充满二氧化碳(CO2)的自封袋内，迅速带回实验室。经4层纱布过滤后用于接种。在获取瘤胃液的整个过程中都要严格厌氧。人工缓冲液按照Theodorou等[17]的方法配制。将瘤胃液与人工缓冲液在厌氧条件下按照1∶9的体积比混合均匀，制成混合培养液。事先在180 mL发酵瓶中称取1 g未处理玉米秸秆或蒸汽爆破玉米秸秆作为体外发酵底物，并按照试验设计添加不同剂量的尿素，随后厌氧分装100 mL混合培养液于发酵瓶中，密封，置于39 ℃恒温培养箱中培养72 h。

1.5 发酵参数测定

体外模拟瘤胃发酵过程中，参照Theodorou等[17]描述的方法测定总产气量。体外发酵72 h后，迅速从各发酵瓶中取5 mL发酵液用pH计(Ecoscan pH 5,Singapore)测定pH，随后置于冰水混合物中终止发酵。收集发酵液，分装后于-20 ℃冰箱保存。参照Weatherburn[18]的方法测定NH3-N浓度，参考申军士等[19]的气相色谱法测定挥发性脂肪酸(VFA)浓度；参照Liu等[20]的尼龙袋法，将发酵后的底物全部转移至已称好的尼龙滤袋中，烘干称重，计算DMD。采用Gompertz模型分析产气动态参数变化[21-22]。应用非线性软件(R)对体外发酵产气参数进行拟合，统计方程如下：

式中：G为t时刻累积产气量(mL)；A为理论最大产气量(mL)；exp表示带截距的简单指数增长；k为产气速率常数(mL/h)；L为体外发酵产气延滞时间(h)；t为发酵时间点。

1.6 功能微生物数量分析

瘤胃液样品解冻后，9 000 r/min离心10 min，利用珠磨法提取瘤胃微生物总DNA[23-24]，并使用Nanodrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc., Madison, Wisconsin,美国)对提取的发酵液微生物总DNA在260和280 nm下测定吸光度(OD)，OD260/280 nm在1.8～2.0表示纯度较好，可用于下一步分析。参考申军士等[19]的方法构建20 μL反应体系，使用PCR仪(ABI 7500，英国)对瘤胃液中的总菌、甲烷菌、真菌和原虫进行定量分析。分别以总菌的16S rRNA基因、真菌和原虫的18S rRNA基因、甲烷菌的甲基辅酶M还原酶(mcrA)基因作为模板制作各目标微生物定量的标准曲线。实时定量PCR(real-time qPCR)引物序列见表1。

表1 瘤胃目标微生物实时定量PCR引物序列

1.7 数据处理与分析

试验数据经Excel 2007初步整理后，利用SAS 9.4混合模型(mixed model)对所有数据进行双因素方差分析，模型包括玉米秸秆类型效应、尿素添加剂量效应及玉米秸秆类型与尿素添加剂量的交互作用。如果交互作用显著，则不考虑自变量效应，仅对不同玉米秸秆类型条件下不同尿素添加剂量进行差异分析。因为尿素添加剂量不等间距，首先使用SAS IML(交互式矩阵语言)程序对多项式对比系数进行校正，然后采用正交多项式矩阵(orthogonal polynomial contracts)对尿素不同添加剂量进行一次(linear)和二次(quadratic)效应分析。显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 常规养分含量

表2显示了未处理玉米秸秆与蒸汽爆破玉米秸秆样品的常规养分含量。由表可知，蒸汽爆破处理使玉米秸秆的NDF和半纤维素含量分别从72.13%和31.54%下降到52.88%和7.98%，NDS和ADF含量分别从27.87%和40.59%上升到47.12%和44.90%，而DM、CP和Ash含量基本没有发生变化。

表2 玉米秸秆常规养分含量

2.2 总产气量、DMD和产气动力学参数

玉米秸秆体外瘤胃发酵总产气量和DMD数据见图1，产气动力学参数见表3。玉米秸秆类型和尿素添加剂量对总产气量和产气动力学参数[产气速率常数(k)、理论最大产气量(V)、产气延滞时间(L)]不存在显著的交互作用(P>0.05)；蒸汽爆破处理使总产气量和理论最大产气量显著升高(P<0.01)，产气速率常数和体外发酵产气延滞时间显著降低(P<0.01)，同时在不同尿素添加剂量中也表现出差异。总产气量随尿素添加剂量的增加线性降低(P<0.01)。尿素添加剂量与产气动力学参数(产气速率常数、理论最大产气量、产气延滞时间)存在二次剂量效应(P<0.01)。玉米秸秆类型和尿素添加剂量对DMD存在显著的交互作用(P<0.01)，蒸汽爆破玉米秸秆各组的DMD均显著高于未处理玉米秸秆各组(P<0.05)，其中以蒸汽爆破玉米秸秆S-20组最高，未处理玉米秸秆C-20组最低。

试验结果均表示为平均值±标准误，每组重复数为5。数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。S表示玉米秸秆效应，D表示尿素添加剂量效应，S×D表示玉米秸秆类型与尿素添加剂量的交互作用，Lin表示线性剂量效应，Qua表示二次剂量效应。

表3 不同尿素添加剂量对蒸汽爆破玉米秸秆瘤胃体外发酵产气动力学参数的影响

2.3 体外瘤胃发酵参数

2.3.1 发酵液pH和NH3-N浓度

由表4可知，玉米秸秆类型和尿素添加剂量对pH(P<0.01)和NH3-N浓度(P=0.02)存在显著的交互作用。蒸汽爆破玉米秸秆S-100组和未处理玉米秸秆C-100组的pH要显著高于C-0、C-20、S-0和S-20组(P<0.05)，而C-0、C-20和S-20组彼此之间的pH差异不显著(P>0.05)。随着尿素添加剂量的升高，蒸汽爆破玉米秸秆和未处理玉米秸秆的NH3-N浓度均显著升高(P<0.05)，且3个蒸汽爆破玉米秸秆组的NH3-N浓度分别显著低于对应尿素添加剂量的3个未处理玉米秸秆组(P<0.05)。

2.3.2 发酵液VFA浓度

由表4可知，对于总VFA、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸和戊酸浓度和乙丙比来说，玉米秸秆类型和尿素添加剂量之间不存在显著的交互作用(P>0.05)。蒸汽爆破玉米秸秆的总VFA和乙酸浓度显著高于未处理玉米秸秆(P<0.05)，丁酸和异丁酸浓度显著低于未处理秸秆(P<0.05)；随着尿素添加剂量的增加，戊酸浓度存在线性(P=0.02)和二次(P=0.03)剂量效应，总VFA(P<0.05)和乙酸浓度(P=0.04)存在二次剂量效应，以尿素添加剂量为20 mg/dL时总VFA和乙酸浓度最高。玉米秸秆类型和尿素添加剂量对丙酸浓度和乙丙比均无显著影响(P>0.05)。玉米秸秆类型和尿素添加剂量对异戊酸浓度存在显著的交互作用(P=0.03)。当底物秸秆为蒸汽爆破玉米秸秆时，尿素添加剂量对异戊酸浓度的影响不显著(P>0.05)；而当底物秸秆为未处理玉米秸秆时，C-20组的异戊酸浓度显著高于C-0和C-100组(P<0.05)。

表4 不同尿素添加剂量对蒸汽爆破玉米秸秆体外瘤胃发酵液中pH、NH3-N和VFA浓度的影响

续表4项目 Items未处理玉米秸秆 Untreated corn stoverC-0C-20C-100蒸汽爆破玉米秸秆Steam-exploded corn stoverS-0S-20S-100SEMP值 P-valueS尿素 UreaDLinQuaS×D丙酸 Propionate/(mmol/L)14.615.113.714.514.915.70.5180.220.660.980.370.06乙丙比 Acetate/propionate4.184.154.534.644.744.230.2420.220.950.830.830.16丁酸 Butyrate/(mmol/L)6.616.796.536.166.046.030.158<0.010.670.420.710.60异丁酸 Isobutyrate/(mmol/L)0.620.610.590.610.540.550.015<0.010.030.060.060.26戊酸 Valerate/(mmol/L)0.390.450.470.400.430.420.0150.13<0.010.020.030.12异戊酸 Isovalerate/(mmol/L)0.56b0.65a0.56b0.50bc0.49bc0.45c0.019<0.01<0.010.040.010.03

2.4 发酵液功能微生物数量

由表5可知，玉米秸秆类型与尿素添加剂量对于总菌(P<0.01)、甲烷菌(P=0.04)和原虫数量(P<0.01)存在显著交互作用，其中均以蒸汽爆破玉米秸秆S-0组最高，未处理玉米秸秆C-100组最低。而对于真菌数量来说，玉米秸秆类型与尿素添加剂量之间不存在显著的交互作用(P>0.05)，蒸汽爆破玉米秸秆组的真菌数量显著高于未处理玉米秸秆组(P<0.01)，尿素添加剂量也显著影响真菌数量(P<0.01)。随着尿素添加剂量的增加，真菌数量存在线性(P<0.01)和二次(P=0.04)剂量效应，以尿素添加剂量为20 mg/dL时的真菌数量最高。

表5 不同尿素添加剂量对蒸汽爆破玉米秸秆体外瘤胃发酵液中功能微生物数量的影响

3 讨 论

3.1 蒸汽爆破处理对玉米秸秆常规养分含量的影响

玉米秸秆的纤维素和半纤维素含量高，通过对常规养分含量进行测定，可以评估半纤维素和纤维素在蒸汽爆破过程中的降解情况。本研究发现，蒸汽爆破使玉米秸秆中的NDF和半纤维素含量降低，而ADF和NDS含量升高。半纤维素在高温高压处理下易降解为可溶性单糖或低聚糖，此外，乙酰纤维素产生的乙酸会进一步加速纤维素和半纤维素的降解[28-31]。本研究中，蒸汽爆破玉米秸秆中半纤维素含量较未处理玉米秸秆明显降低，降低了23.56%，表明蒸汽爆破使玉米秸秆中半纤维素的降解或去除程度增强，此结果与Shi等[32]、Chang等[33]和Zhao等[34]的研究结果相同。本试验中蒸汽爆破玉米秸秆中NDS含量的增加可能是由于蒸汽爆破使半纤维素分解所致，这进一步证明了玉米秸秆在蒸汽爆破处理后的易降解性。Shi等[32]和Zhao等[34]研究发现，玉米秸秆经蒸汽爆破处理后木质素含量显著增加。因此推测本研究中蒸汽爆破玉米秸秆中ADF含量的增加可能是木质素含量增加所致，但木质素含量增加的具体原因仍不清楚，相关研究者也未给出合理解释，后续还需更深入的试验加以探究。

3.2 蒸汽爆破玉米秸秆中添加不同剂量尿素对体外瘤胃发酵总产气量和DMD的影响

瘤胃体外发酵产气量是评定反刍动物瘤胃发酵程度的一个重要指标，与DMD存在一定的正相关关系，并且体外发酵产气量的高低也能反映瘤胃内微生物活性的强弱[35]。本研究发现，蒸汽爆破玉米秸秆组的总产气量和DMD较未处理玉米秸秆组显著提高，与李德勇等[36]、Zhao等[34]和He等[4]所报道的结果相一致，说明蒸汽爆破可以提高瘤胃微生物的活性和消化速率，对玉米秸秆的降解有一定的促进作用。有研究指出，瘤胃液中适宜的NH3-N浓度在17～25 mg/dL，过低和过高都会对瘤胃发酵产生不利影响[13]。本研究发现，不同尿素添加剂量对DMD没有产生显著影响，但是添加尿素使总产气量显著降低，并呈现出显著的线性剂量效应。20 mg/dL剂量组的总产气量下降不明显，说明适宜氨浓度不会影响产气量，但100 mg/dL剂量组的产气量下降明显，其原因可能与发酵液pH的升高有关。人工缓冲液中含有大量碳酸氢根离子，在低pH条件下会还原产生CO2，而在本试验条件下添加高剂量尿素使得发酵液pH显著升高，进而导致产气量减少。

3.3 不同尿素添加剂量对蒸汽爆破玉米秸秆体外瘤胃发酵参数的影响

瘤胃液内NH3-N浓度的高低直接反映了瘤胃内微生物对氮的利用情况[14]。本试验发现，蒸汽爆破玉米秸秆相较于未处理玉米秸秆，其发酵液NH3-N浓度显著降低，这与Zhao等[34]和李德勇等[36]的研究结果一致，表明蒸汽爆破处理玉米秸秆提高了瘤胃微生物对氨的利用效率。在本试验中，随着尿素添加剂量的增加，发酵液pH和NH3-N浓度显著升高，这是因为尿素在进入瘤胃后会被完全降解为氨，氨水解呈碱性，所以随着尿素添加剂量的增加pH显著升高。Prasad等[37]在水稻秸秆中添加尿素后发现奶牛的瘤胃液pH升高，与本试验结果相同。这些结果表明，当尿素添加剂量过高时会显著提高瘤胃液氨浓度和pH，但对玉米秸秆进行蒸汽爆破处理可以提高瘤胃微生物对氨的利用效率，缓解高氨对瘤胃发酵产生的不利影响。

瘤胃VFA是反刍动物重要的能量来源，可为机体提供70%～80%的可消化能[38]。本研究发现，玉米秸秆经蒸汽爆破处理后，发酵液中总VFA和乙酸浓度显著升高，总VFA浓度的升高表明微生物的生长和发酵能力提高，对能量的利用效率提高。乙酸是纤维分解菌的主要产物，乙酸浓度与纤维分解菌数量之间存在一定的正相关关系，蒸汽爆破处理后的纤维素可接触面积增大，使得纤维分解菌数量增多，因此发酵液中乙酸浓度也相应增加。发酵液中丙酸浓度和乙丙比没有因蒸汽爆破处理发生显著变化，说明蒸汽爆破处理并未改变瘤胃发酵模式，此结果与李德勇等[36]和He等[4]的研究结果不一致，可能是由于所选的秸秆类型不同导致蒸汽爆破后的物理化学性质变化存在差异。在本试验中，尿素添加剂量与发酵液中总VFA、乙酸和戊酸浓度存在显著的二次剂量效应，均以尿素添加剂量为20 mg/dL时最高，说明在本底氨浓度基础上添加此剂量尿素所分解产生氨的最终浓度(16.92～18.87 mg/dL)有利于瘤胃微生物的发酵和对能量的利用。

3.4 不同尿素添加剂量对蒸汽爆破玉米秸秆体外瘤胃发酵液中功能微生物数量的影响

反刍动物自身不能分泌纤维素降解酶，所以饲粮中的纤维素主要依靠瘤胃内存在的微生物来分解，这些微生物主要包括细菌、古菌、真菌和原生动物[39]，因此它们的存在与反刍动物能量利用密切相关。有研究报道，经过蒸汽爆炸处理的玉米秸秆，其孔隙率和微生物可定植面积都有所增加[40]。本研究发现，蒸汽爆破玉米秸秆发酵液中总菌、甲烷菌、真菌和原虫数量要显著高于未处理玉米秸秆，表明蒸汽爆破通过破坏底物的结构，促进了微生物的生长定植，此结果与总产气量的增加和DMD的提高相一致。Zhao等[34]用扫描电镜观察玉米秸秆的物理结构变化发现，蒸汽爆破处理显著增加了玉米秸秆在瘤胃中的微生物定植，在培养4、12和24 h时，蒸汽爆破玉米秸秆表面的微生物数量明显多于未处理玉米秸秆，与本试验结果一致。因此，蒸汽爆破可通过破坏底物结构来增加瘤胃微生物数量，从而达到提高底物利用率的目的。

瘤胃微生物可以介导瘤胃内氨的生成，同时瘤胃内产生的氨也会反馈影响微生物的数量与结构[41]。在适宜的氨浓度范围内，瘤胃微生物可以有效利用NH3-N[42]，但如果氨浓度过高，就会对微生物产生抑制作用，进而影响微生物的正常功能。本研究发现，在未处理秸秆组中，当尿素添加剂量达到100 mg/dL时，发酵液中氨浓度达44.05～47.69 mg/dL，总菌、甲烷菌和原虫的数量显著降低，这说明高浓度的氨会抑制瘤胃微生物的生长和繁殖，进而影响其对底物的发酵利用。但是我们发现，在以蒸汽爆破玉米秸秆为底物时，100 mg/dL的尿素添加剂量并没有对发酵液中总菌、甲烷菌和原虫的数量产生显著抑制作用，这与未处理秸秆组得到的结果相反，这说明蒸汽爆破通过提高能量的释放速率，在一定程度上使尿素氨的释放与能量释放更为同步，促进瘤胃微生物的生长繁殖以提高NH3-N的利用效率，进而缓解高氨浓度对瘤胃发酵产生的不利影响。

4 结 论

蒸汽爆破处理改变玉米秸秆的化学组成，可通过增加功能微生物数量改善瘤胃发酵；在本底氨浓度(10.82 mg/dL)的基础上，适量(20 mg/dL)添加尿素可提高玉米秸秆瘤胃体外发酵总VFA产量，而过量添加尿素则会抑制玉米秸秆体外瘤胃发酵，但蒸汽爆破处理可缓解高氨浓度对其产生的不利影响。