晋南牛固醇结合原件蛋白1基因在不同组织中表达规律及其与肌内脂肪含量的相关性研究

程 景 张元庆 王 曦 张丹丹 李 博 靳 光 王栋才 徐 芳 孙锐锋 梁 圆 薛丽娜

(山西农业大学(山西省农业科学院)动物科学学院，太原 030032)

随着人们生活质量的提高，优质牛肉备受消费者的青睐。晋南牛是我国古老而优秀的黄牛品种，具有良好的肉用性能，是可向专门化肉牛品种方向选育的地方黄牛品种之一。肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)是沉积在骨骼肌肌纤维和肌束间的脂肪组织，也称为大理石花纹脂肪组织。IMF含量和分布决定了牛肉的大理石花纹的沉积[1]。作为衡量牛肉品质的重要指标，IMF含量和脂肪酸的组成是决定肉品质的重要因素，IMF对肉的感官品质和嫩度都有影响[2]，而不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)和饱和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)的比例、UFA中脂肪酸的组成对改善肉的风味、提高营养价值具有重要意义[3]。

固醇调节原件结合蛋白(sterol regulatory element binding proteins,SREBPs)属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子家族，是膜结合蛋白，其主要通过促进糖酵解和脂肪生成而在能量调节中发挥重要的作用[4]。哺乳动物SREBPs基因包括SREBP1、SREBP2 2种。从NCBI上GenBank中的数据可知，在牛上，SREBP1基因定位于19号染色体，mRNA长度3 983，编码1 146个氨基酸；SREBP2基因定位于5号染色体，mRNA长度5 194，编码1 140个氨基酸。其中SREBP1基因主要激活脂肪酸合成，SREBP2基因则主要调控胆固醇代谢[5]。SREBP1基因的增加均可显著促进细胞中脂滴的形成[6]，且大量研究还表明，该基因与脂肪、胆固醇代谢紊乱等引起的诸多疾病和氧化应激等密切相关[7-9]。研究SREBP1基因在脂肪代谢中的调控作用，对阐明肌内脂肪形成、改善牛肉品质具有重要意义。

SREBP1基因在脂肪形成中具有重要作用，且目前未见对晋南牛SREBP1基因表达规律的相关报道，因此，本研究以晋南牛为研究对象，分析检测不同组织中SREBP1基因的表达规律并分析不同IMF含量个体SREBP1基因在背最长肌(longissimusdorsi,LP)、皮下脂肪(subcutaneous fat,SF)、腹腔脂肪(abdominal fat,AF)、胸腔脂肪(chest fat,CF)中的表达规律，为研究牛SREBP1基因在IMF沉积过程中的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用12头8月龄、体重为(264.00±30.49) kg的晋南牛，进行分阶段育肥。饲粮按《肉牛营养需要和饲养标准》配制，饲养管理方式按照山西农业大学(山西省农业科学院)畜牧兽医研究所实验牛场日常饲养执行，所有牛只饲养管理条件一致。试验牛散栏饲养，每日08：00和19：00各饲喂1次，自由采食，饮水充足。屠宰时体重为(615.17±43.40) kg，牛只采用上线屠宰，电击后15 min内进行样本采集。使用RNAnase清除剂(Solarbio,北京索莱宝科技有限公司)处理过的剪刀采集心脏、脾脏、肾脏、肝脏、LP、SF、AF、CF，每个部位3个重复，迅速投入冻存管并放入液氮罐中带回实验室-80 ℃保存，用于RNA提取；排酸24 h后，取第12～13肋间左侧胴体LP，测定IMF含量后，选取IMF含量最高的3头(IMF含量分别为11.50%、13.30%、12.10%)和最低的3头(IMF含量分别为4.40%、4.50%、4.30%)，测定肉品质相关指标。

1.2 试验方法

1.2.1 Total RNA的提取和cDNA的合成

采用百泰克(北京)试剂盒提取各组织中的Total RNA，经NanoDrop-2000超微量核酸蛋白测定仪(Thermo Fisher,德国)和电泳检测纯度和完整性后使用反转录试剂盒(TaKaRa)合成cDNA。

1.2.2SREBP1基因和内参基因的设计及合成

根据GenBank公布的牛SREBP1基因序列和β-微管蛋白(TUBB)基因序列，参照实时荧光定量PCR(real time-qPCR)引物设计原则，应用NCBI primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)设计引物。引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。引物信息见表1。

表1 引物信息

1.2.3 实时荧光定量PCR

以不同牛只、不同组织的cDNA为模板，以TUBB作为内参基因开展实时荧光定量PCR试验。反应体系为20 μL：cDNA 2 μL，Format Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，SYBR Premix PCR 10 μL，补充dd H2O至20 μL。使用Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR(Qiagen,德国)进行检测，反应条件：95 ℃变性1 min；60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；70～95 ℃熔解20 s，每0.5 ℃读取1次荧光值，每个样品设置3个重复，每个个体进行3次技术重复，阴性对照为无cDNA模板的样品。

1.2.4 LP脂肪酸及氨基酸组成的测定

将采集的肌肉样品密封-4 ℃保存，在24 h内送至华测检测认证集团股份有限公司，测定脂肪酸37种、氨基酸16种。样品经研磨机低温匀浆后备用，随后对牛肉中的总脂肪酸和氨基酸组成进行检测分析。其中脂肪酸含量测定方法依照GB 5009.168《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》，使用GC-2010Plus气相色谱仪(Shimadzu,日本)测定，测定方法为内标法，内标物为十一碳酸甘油三酯，色谱柱选用SP-2560气相毛细管柱(Supelco,美国)，规格为100 m×0.25 mm×0.20 μm(长度×内径×膜厚)，固定相为聚二氰丙基硅氧烷；氨基酸含量测定方法依照GB 5009.124《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》，使用LA-8080全自动氨基酸分析仪(Hitachi,日本)测定。为保证测定结果的准确性，同时加送2个样品的平行样。

1.3 数据分析

目标基因相对表达量采用2-ΔΔCt法[10]计算，原始数据使用Excel 2019处理。使用SPSS 21.0的一般线性模型进行单因素方差分析(one-way ANOVA,LSD)和Duncan氏多重比较，采用Pearson相关性分析。结果采用平均值±标准差表示，以P<0.05为差异显著的判定标准，P<0.01为差异极显著的判断标准。

2 结果与分析

2.1 不同IMF含量晋南牛生长性能、屠宰性能及肉品质

由表2可知，HIF组平均日增重(0.76 kg)高于LIF组(0.73 kg)，但差异不显著(P>0.05)；LIF组胴体重、屠宰率均显著高于HIF组(P<0.05)。HIF组第12～13肋间LP的pH48 h、水分含量均小于LIF组(P>0.05)，滴水损失高于LIF组(P>0.05)；LIF组剪切力显著高于HIF组(P<0.05)，LIF组IMF含量为4.40%，HIF组IMF含量为12.30%，两者之间差异极显著(P<0.01)。

表2 不同IMF含量晋南牛生长性能、屠宰性能和肉品质

2.2 不同IMF含量晋南牛LP中脂肪酸组成

由表3可知，2组均未检出C14∶0以下的脂肪酸。其中，HIF组中LP的总脂肪酸(TFA)含量为9.698%，LIF组的TFA含量为4.064%，两者之间差异显著(P<0.05)。HIF组中豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸含量均显著或极显著高于LIF组(P<0.05或P<0.01)；HIF组中芥酸含量也高于LIF组，但差异不显著(P>0.05)；亚麻酸含量在2组基本相同，均为0.018%。

表3 不同IMF含量晋南牛背最长肌中脂肪酸组成

2.3 不同IMF含量晋南牛LP中氨基酸组成

由表4可知，苯丙氨酸含量在2组中基本相同，均为0.84%，除苯丙氨酸外，HIF组LP中其余所测氨基酸含量均低于LIF组中对应氨基酸，差异均不显著(P>0.05)；LIF组氨基酸总量高于HIF组，但差异不显著(P>0.05)。

表4 不同IMF含量晋南牛背最长肌中氨基酸组成

2.4 晋南牛SREBP1基因的组织表达谱分析

利用实时荧光定量PCR检测SREBP1基因在晋南牛个体组织中的表达差异，SREBP1基因在所测组织中均有表达(图1)，其中在LP中的相对表达量较高，且显著高于其他组织(P<0.05)；在肾脏、肝脏和脂肪组织中次之；在心脏、脾脏中相对表达量均显著低于其他组织(P<0.05)。

数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.5 不同IMF含量晋南牛不同组织中SREBP1基因的表达水平

通过实时荧光定量PCR法检测SREBP1基因在HIF组和LIF组中的表达水平(图2)，结果显示，在LP中，HIF组SREBP1基因相对表达量极显著高于LIF组(P<0.01)；在SF中，HIF组SREBP1基因相对表达量略高于LIF组(P=0.052)；在SF和CF中，HIF组SREBP1基因相对表达量极显著低于LIF组(P<0.01)。

2.6 不同组织中SREBP1基因表达水平与IMF含量的相关性

由表7可知，LP、SF中SREBP1基因相对表达量与IMF含量均呈正相关，其中LP中SREBP1基因相对表达量与IMF含量相关系数为0.987，呈极显著正相关(P<0.01)；AF、CF中SREBP1基因相对表达量与IMF含量呈极显著负相关(P<0.01)。

数据柱形标注**表示差异极显著(P<0.01)。

3 讨 论

3.1 不同IMF含量晋南牛屠宰性能及肉品质

本研究中，LIF组IMF含量为4.40%，HIF组IMF含量为12.30%，王小梅等[11]测定红安格斯牛、中国西门塔尔牛、草原红牛、夏洛莱牛的LP IMF含量在5.01%～5.34%，张海波[12]测定20月龄西杂阉公牛的IMF含量为4.08%和4.54%，Ueda等[13]测定和牛脂肪含量从4.8%到39.0%不等，说明不同品种肉牛IMF含量相差较大，这与试验用牛年龄、品种等因素相关，且本试验结果显示，相同饲养条件下晋南牛LP IMF含量差异也较大，说明同一品种不同个体之间脂肪的合成、分解代谢也可能大不相同[14-15]。HIF组屠宰率、水分含量、剪切力均低于LIF组，这和毛衍伟等[16]的研究一致。Ueda等[13]认为牛肉水分含量与IMF含量呈负相关是因为脂肪替代了水分。多数研究认为，IMF含量提高，牛肉的剪切力降低[17-18]。本试验条件下，LIF组的IMF含量为4.45%，剪切力为63.40 N，HIF组的IMF含量为12.40%，剪切力为57.45 N。而Liang等[19]数据中，IMF含量为4.26%时，剪切力为50.62 N，IMF含量为11.52%时，剪切力为40.08 N，虽然剪切力在数据上差异较大，这可能与样品前处理有关，但其趋势相同，均随着IMF含量的增加，剪切力降低。本试验委托当地牛肉加工企业屠宰，因企业对肉品质和经济效益等需求，工人在胴体处理时过度修剪脂肪，是导致HIF组的肉牛的屠宰率和胴体重低于LIF组的肉牛最可能的原因。

表7 晋南牛不同组织部位SREBP1基因相对

3.2 不同IMF含量晋南牛LP中脂肪酸、氨基酸组成

脂肪酸沉积过程实质上是脂肪酸酯化为甘油三酯(TG)并沉积为体脂的过程。肉牛可从饲粮中摄取脂肪酸，通过小肠分解为游离脂肪酸，进一步氧化或者形成TG并逐渐沉积到体内[20-21]。也就是说如果机体内脂肪沉积较多，则相应的脂肪酸含量也高。本试验条件下，HIF组的TFA含量远远高于LIF组，这与HIF组IMF含量高于LIF组有关。肌肉中氨基酸受动物品种、年龄等因素的影响[22]，多数人认为氨基酸和肉风味相关，很少有氨基酸和IMF含量之间关系的研究。Ueda等[13]发现，几乎所有氨基酸和IMF含量均呈显著负相关，肌肉中脂肪沉积可能降低氨基酸含量，其原因是育肥后期肉牛大量积累脂肪，肌肉生长速度慢，蛋白质合成和降解的速率降低。本研究中无论是所测氨基酸总量，还是各氨基酸含量(除苯丙氨酸含量基本相同外)，HIF组均低于LIF组，与上述结果一致。

3.3 晋南牛SREBP1基因的组织表达特性分析

本研究表明，SREBP1基因在晋南牛不同组织中广泛表达，且有明显的组织差异性。人类的研究上发现，SREBP1基因在脂肪组织和肌肉组织中表达量较为丰富，首先在棕色脂肪组织中表达，其次是肝脏、白色脂肪组织和肾脏[23]。本试验条件下，晋南牛SREBP1基因的组织表达谱与人类基本一致，在LP和脂肪组织、肝脏相对表达量较高，随之是肾脏，而在心肌和脾脏中相对表达量低。但本研究中SREBP1基因在晋南牛背最长肌中的相对表达量最高，与黄胥莱等[24]的研究不一致，这可能是因为LP中脂肪沉积明显，而取样方法与部位的不同导致样品中脂肪组织含量的不同而影响测定结果。

3.4 不同IMF含量晋南牛LP、脂肪组织中SREBP1基因相对表达量及其与IMF含量的相关性

IMF沉积是脂肪酸合成与分解的综合反映，受到脂肪酸合成关键基因和脂肪酸分解关键基因的调控。多项研究表明，SREBP1基因与机体脂肪生成基因的调节有很重要的相关性，SREBP1可以直接激活脂肪酸、胆固醇、TG以及磷脂的生物合成，脂肪代谢过程中的多个基因的表达[25-26]。官久强等[27]经试验发现犏牛组IMF含量高于牦牛组，而LP中SREBP1基因的相对表达量犏牛组也高于牦牛组。这与本试验研究结果一致。不同水平IMF含量晋南牛牛群，SF中SREBP1基因相对表达量HIF组略高于LIF组，AF、CF中SREBP1基因相对表达量均为LIF组高于HIF组，这可能是因为不同部位的脂肪组织具有特异性的基因表达模式[28]，也可能是因为IMF含量高的个体，脂肪在内脏生成已经很少，主要在肌肉和皮下，其他原因还有待继续深入研究与探讨。

金世杰等[29]证明肌肉组织中SREBP1基因表达在12～20月龄期间与IMF含量具有正相关性。徐丽[30]对SREBP1基因过表达可增加牛胎儿骨骼肌成纤维细胞内脂肪的合成，本研究中SREBP1基因在LP中的相对表达量与IMF含量呈极显著正相关，与上述报道一致。这说明通过SREBP1基因表达对脂肪沉积有正向调控作用，对IMF的沉积有一定的积极作用，与SREBP1基因的生理作用一致。

4 结 论

晋南牛SREBP1基因在所测组织中均有表达，且不同个体所测组织中的表达规律基本相同，均以LP中相对表达量最高，脂肪组织中也相对丰富；不同IMF含量晋南牛SREBP1基因表达模式不同，LP中HIF组较高，而AF、CF中LIF组高；SREBP1基因正向调控LP中IMF沉积，可作为影响晋南牛IMF含量的候选基因。