鸡肉粉替代秘鲁鱼粉对大口黑鲈生长性能、血清生化指标、肠道及肝脏组织结构的影响

马 利 穆 苑 李 维 耿 旭 蒋 明 文 华 王国霞 李 勇*

(1.中粮饲料有限公司，北京 100020；2.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223；3.广东省农业科学院动物科学研究所，农业部华南动物营养与饲料重点实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广州 510640)

鱼粉具有平衡的氨基酸模式和适口性好等优点，是水产饲料的首选蛋白质源，在水产养殖中被大量利用，特别是肉食性鱼类饲料中鱼粉占比一般在30%以上[1]。我国每年水产用鱼粉消耗量在150万t以上，然而近年来鱼粉供应有限及价格高，制约了水产养殖业的可持续发展和海洋食品的健康增长[2]。因此，为水产动物特别是肉食性养殖对象寻找开发新的蛋白质资源是饲料发展的必然趋势，也是保护海洋资源的必然选择[3]。

鸡肉粉是畜禽屠宰厂副产品经提炼油脂和粉碎后所得到的粉状产品，其粗蛋白质和粗脂肪含量与鱼粉相近，氨基酸平衡较好，已成为一种常规的鱼粉替代蛋白质原料[4]。国内外已有研究表明，鸡肉粉可适量替代金鲳鱼(Trachinotusovatus)[4]、黄鳝(Monopterusalbus)[5]、海鲈(Lateolabraxjaponicas)[6]、乌鳢(Channastriata)[7]、驼背鲈(Cromileptesaltivelis)[8]、卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)[9]、凡纳滨对虾(Litopenarusvannamei)[10]、罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)[11]和大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[12]等饲料中的鱼粉。

大口黑鲈(Micropterussalmoides)，又名加州鲈，为肉食性温水性鱼类，具有生长快、肉质鲜美、抗病力强等优点。近年来，已经开发出大口黑鲈全程养殖投喂饲料的技术，使其养殖规模得到迅速扩大[13]。大口黑鲈的营养需求和饲料配制技术已经得到初步研究[14-16]，其对蛋白质需求较高(45.0%～51.6%)[17-18]，在商品饲料中的鱼粉含量为40%～50%。因此，亟需开展该养殖品种的鱼粉替代技术研究，以降低该养殖品种对鱼粉资源的依赖。目前文献资料显示大口黑鲈饲料中南极磷虾粉[19]、发酵豆粕[20]等可部分替代鱼粉。鉴于鸡肉粉在其他肉食性鱼类饲料中良好的表现，我们推测大口黑鲈饲料中鸡肉粉也可部分替代鱼粉。因此，本试验以实用饲料配方为基础，研究鸡肉粉(宠物级)替代秘鲁鱼粉对大口黑鲈生长性能、血清生化指标、肠道及肝脏组织结构的影响，为鸡肉粉在大口黑鲈饲料中的应用提供理论依据和技术参数。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

本试验以宠物级鸡肉粉替代秘鲁鱼粉，试验配方组成以秘鲁鱼粉、墨西哥鱼粉、越南鱼粉、宠物级鸡肉粉、血球蛋白粉和豆粕为蛋白质源，面粉和木薯淀粉为糖源，鱼油、豆油和大豆卵磷脂为脂肪源，按照表1配比配制5种试验饲料，分别记作T1、T2、T3、T4和T5。T1含有秘鲁鱼粉30%和宠物级鸡肉粉10%，T2～T5中的鸡肉粉以7.5%(占比饲料)的梯度增加，秘鲁鱼粉和宠物级鸡肉粉的干物质、粗蛋白质体外消化率分别为55.52%和59.38%、61.80%和63.96%，试验饲料组成见表1，营养水平和氨基酸组成见表2。饲料制备前，将饲料原料粉碎后过80目筛，按照试验设计配方混合、制粒直径2.0 mm的颗粒饲料，在阴凉处风干，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

表1 试验饲料组成(干物质基础)

表2 试验饲料营养水平和氨基酸组成(干物质基础)

1.2 养殖管理

养殖试验在广东省农业科学院动物科学研究所水产研究室循环水养殖系统中进行，每个玻璃钢桶水体有效容积300 L。试验用大口黑鲈来自广东省清远市大口黑鲈繁殖场，运回后经检疫消毒后，暂养于水泥池中，用T1～T5等质量混合饲料驯养2周后分组，挑选700尾体表健康、活力强的试验鱼，随机分为5组，每组4个重复，每个重复35尾，初始体质量约为6.88 g。养殖期间每天表观饱食投喂2次(08:00—08：30；17:00—17：30)。养殖期间自然光照，水温为23.0～30.0 ℃，pH为7.6±0.3，溶解氧含量>5.5 mg/L，氨氮含量<0.2 mg/L，亚硝酸盐含量<0.05 mg/L。养殖周期56 d。

1.3 样品采集与指标测定

生长性能、形态学指标和肠道消化酶活性：养殖试验开始时和结束后称重每个养殖桶大口黑鲈总重，并记录总尾数，用于计算增重率(WGR)、饲料系数(FCR)、成活率(SR)和特定生长率(SGR)。养殖试验结束后，禁食24 h，从养殖桶中随机选取6条鱼，测定体长、体质量后，分离出内脏团、肝脏、肠道、腹腔脂肪并分别称重，用于计算肥满度(CF)、脏体比(VSI)、肝体比(HSI)、肠体比(II)和腹脂指数(IPR)，并分离出全肠用于消化酶活性指标测定，包括脂肪酶(LPS)、淀粉酶(AMS)和胰蛋白酶(TPS)，肠道用0.9%的生理盐水清洗、剪碎，按照组织∶生理盐水=1∶9(W/V)，冰浴匀浆后离心(4 ℃，5 000 r/min，20 min)，取上清液作为酶粗提液；TPS活性用试剂盒中专用的匀浆介质按试剂盒要求进行测定，LPS和AMS活性采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定。

饲料和全鱼营养成分：养殖试验结束后，禁食24 h后从每个养殖桶中随机选取3尾鱼烘干粉碎，置于-20 ℃冰箱中保存，用于全鱼营养成分分析。饲料和全鱼水分含量采用105 ℃烘箱烘干至恒重的方法(GB/T 6435—2014)检测，粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(GB/T 6432—1994)检测，粗脂肪含量采用石油乙醚抽提法(GB/T 6433—2006)检测，粗灰分含量采用550 ℃高温灼烧法(GB/T 6438—2007)检测；原料、饲料中氨基酸(除色氨酸外)含量采用高速氨基酸自动分析仪(Model 835-50，日本日立公司)进行测定。

原料干物质胃仿生消化试验：称取1 g样品，置于装有透析袋的模拟消化器中，再往透析袋中加入20 mL模拟小肠液，将模拟消化器置于单胃动物仿生消化仪(SDS)单胃动物仿生消化系统中，仿生消化结束后，用注射器(约5 mL去离子水)将透析袋中的未消化残渣无损失地转移到已知绝干重的90 mm培养皿中，在65 ℃烘干至无水痕(约12 h)，再105 ℃烘干至恒重，留样待测粗蛋白质含量。

血清生化指标：停食24 h后，每个养殖桶随机取6尾鱼，尾静脉取血混合后4 ℃下4 000 r/min离心10 min制备血清样品，-80 ℃冰箱中保存，用于血清生化和抗氧化能力指标分析，包括总蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、胆固醇(cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterin，HDL-C)、尿素氮(urea nitrogen，UN)、球蛋白(globulin，GLO)、葡萄糖(glucose，GLU)含量及谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase ，ALP)活性，采用全自动生化分析仪(日立7600，日本)进行测定；酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)活性和总抗氧化能力(total antioxidization capacity，T-AOC)采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定。

肠道和肝脏组织切片：养殖试验结束后，禁食24 h后从每个养殖桶中随机选取3尾鱼，分离出肠道和肝脏置于10%福尔马林中固定，室温保存，用于肠道和肝脏组织切片制作。固定好的肠道样品严格按照武汉赛维尔生物科技有限公司病理试验检测SOP程序进行，修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片，最后制成镜检合格的样片，每张切片挑选40倍视野进行拍照，应用Image-Pro Plus 6.0软件以右下角40倍标尺为标准，每张切片选取5根完整的绒毛，分别测量绒毛高度、绒毛宽度、肌层厚度、杯状细胞数；固定好的肝脏样品严格按照武汉赛维尔生物科技有限公司病理试验检测SOP程序进行，修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片，最后制成镜检合格的样片，使用CaseViewer2.2浏览数字切片，在不同倍数下详细观察组织结构，对切片中典型病理改变如炎症、坏死、变性、增生以及纤维化等情况进行文字描述，并反映出片子之间的差异，使用成像显微镜拍摄或使用CaseViewer2.2截取对应不同的典型病变部位图，并在Word文档中用箭头标识说明。

1.4 计算公式

干物质消化率(%)=[(Wt-Wdt)/Wt]×100；
粗蛋白质消化率(%)=[(Wp-Wdp)/Wp]×100；
成活率(%)=(Nt/N0)×100；
增重率(%)=100×(Wt/Nt-W0/N0)/(W0/N0)；
特定生长率(%/d)=[(lnWt/Nt-lnW0/N0)/t]×100；
饲料系数=Wt/(Wt-W0)；
肥满度(g/cm3)=(W/L3)×100；
脏体比(%)=(Wv/W)×100；
肝体比(%)=(Wh/W)×100；
肠体比(%)=(Wi/W)×100；
腹脂指数(%)=(Waf/W)×100；
粗蛋白质沉积率(%)=[(Wt×Wtp-
W0×W0p)/(Wf×Wp)]×100；
粗脂肪沉积率(%)=[(Wt×Wtl-
W0×W0l)/(Wf×Wl)]×100；
粗灰分沉积率(%)=[(Wt×Wta-
W0×W0a)/(Wf×Wa)]×100。

式中：Wt为饲料样品重(g)；Wdt为消化后滤渣重(g)；Wdp为消化后滤渣粗蛋白质含量(%)；Nt为终末鱼尾数；N0为初始鱼尾数；t为试验天数(d)；Wh为鱼肝脏重(g)；W为鱼体质量(g)；Wv为鱼内脏重(g)；L为鱼体长(cm)；Waf为鱼腹部脂肪重(g)；Wi为鱼肠道重(g)；Wt为终末鱼体质量(g)；W0为初始鱼体质量(g)；Wtp为终末鱼体的粗蛋白质含量(%)；W0p为初始鱼体的粗蛋白质含量(%)；Wf为摄入饲料量(g)；Wp为饲料中的粗蛋白质含量(%)；Wtl为终末鱼体的粗脂肪含量(%)；W0l为初始鱼体的粗脂肪含量(%)；Wl为饲料中的粗脂肪含量(%)；Wta为终末鱼体的粗灰分含量(%)；W0a为初始鱼体的粗灰分含量(%)；Wa为饲料中的粗灰分含量(%)。

1.5 数据统计分析

试验数据用“平均值士标准误”表示，采用SPSS 18.0软件对数据进行统计学分析，先对数据作单因素方差分析(one-way ANOVA)，若有显著差异，再用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 大口黑鲈生长性能、饲料系数和形态学指标

由表3可知，试验组(T1～T5组)间的终末体量、成活率、增重率、特定生长率和饲料系数差异不显著(P>0.05)，各组间肥满度、脏体比、肝体比和肠体比没有显著性差异(P>0.05)，T4组腹指指数显著高于T3和T5组(P<0.05)。

表3 宠物级鸡肉粉替代秘鲁鱼粉对大口黑鲈生长性能、饲料系数和形态学指标的影响

2.2 大口黑鲈鱼体成分和营养素沉积率

由表4可知，鸡肉粉替代秘鲁鱼粉对大口黑鲈全鱼的水分、粗脂肪和粗灰分含量均没有显著影响(P>0.05)，对粗蛋白质沉积率和粗脂肪沉积率也没有显著影响(P>0.05)，T4组的粗灰分沉积率显著高于T1和T2组(P<0.05)。

表4 宠物级鸡肉粉替代秘鲁鱼粉对大口黑鲈体成分和营养素沉积率的影响(湿物质基础)

2.3 大口黑鲈血清生化指标和抗氧化能力

由表5可知，鸡肉粉替代鱼粉对大口黑鲈血清总蛋白、白蛋白、球蛋白、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高低密度蛋白胆固醇、尿素氮、葡萄糖含量及谷丙转氨酶、谷草转氨酶、酸性磷酸酶活性和总抗氧化能力均无显著影响(P>0.05)。

表5 宠物级鸡肉粉替代秘鲁鱼粉对大口黑鲈血清生化指标和抗氧化能力的影响

2.4 大口黑鲈肠道消化酶活性

由表6可知，各组间大口黑鲈肠道的脂肪酶和胰蛋白酶活性均无显著差异(P>0.05)，T4和T5组肠道的淀粉酶活性显著低于T1组(P<0.05)。

表6 宠物级鸡肉粉替代秘鲁鱼粉对大口黑鲈肠道消化酶活性的影响

2.5 大口黑鲈肠道组织结构

由表7可知，各组间大口黑鲈肠道绒毛长度、肌层厚度和杯状细胞数没有显著差异(P>0.05)，T5组肠道绒毛宽度显著高于T2和T3组(P<0.05)。

表7 宠物级鸡肉粉替代秘鲁鱼粉对大口黑鲈肠道组织结构的影响

2.6 大口黑鲈肝脏组织结构

如图1所示，各组肝脏组织未见坏死，T1组肝细胞体积正常，细胞膜较圆，细胞核大而圆，且细胞间界线明显，T2、T3和T4组的肝细胞轮廓都明显，细胞核居中，T5组肝细胞轮廓界限不清，细胞核偏向细胞一侧较多。

肝细胞空泡变性，如黑色箭头所示；细胞核偏向细胞一侧，如黄色箭头所示；细胞界限不清，如蓝色箭头所示。

3 讨 论

3.1 宠物级鸡肉粉替代秘鲁鱼粉对大口黑鲈生长性能、饲料利用和形态学指标的影响

本试验结果表明，随着宠物级鸡肉粉含量从10%增加到40%，秘鲁鱼粉含量从30%降低到0，对大口黑鲈的成活率、增重率、特定生长率、饲料系数、脏体比、肝体比、肠体比和肥满度没有显著影响。本试验的增重率均达到792.69%以上，特定生长率达到4.29或以上，这一结果与类似的大口黑鲈养殖试验结果[14-20]相比，本试验鱼生长较好。这说明本试验中的试验鱼均处于较好的生长状态，在本试验条件下，40%的宠物级鸡肉粉对大口黑鲈生长无明显负面影响。这与易新文等[21]对卵形鲳鲹的研究结果相似，试验饲料中进口鸡肉粉含量从6%增加到18%，鱼粉含量从34%降低到22%，对卵形鲳鲹的生长性能未造成显著影响。Zhu等[22]在军曹鱼(Rachycentroncanadum)上的研究发现，宠物级鸡肉粉替代30.75%的鱼粉蛋白质而不影响军曹鱼的生长性能。曹晓莉等[5]在黄鳝上的研究发现宠物级鸡肉粉替代鱼粉比例不超过45%时，对黄鳝的生长性能无负面影响。

Shapawi等[8]在驼背鲈中的研究发现，饲料级鸡肉粉54.2%替代75.0%鱼粉蛋白质对生长性能和饲料利用没有显著影响，而宠物级鸡肉粉74.0%能替代100.0%的鱼粉蛋白质。但是李宗升等[12]在研究鸡肉粉替代鱼粉对大菱鲆生长的影响中发现，随着鸡肉粉含量从20%增加到80%，鱼粉含量从80%降低到20%时，对大菱鲆的生长性能和饲料利用率有显著影响。以上替代结果的不同可能是由于鸡肉粉的品质等级的不同，会对试验鱼消化吸收造成较大影响，从而导致替代比例的差异；另外试验鱼的种间差异、基础饲料组成差异，也是导致替代比例不同的可能因素。本试验条件下，大口黑鲈总的动物性蛋白质含量相近，以生长性能为评价指标，大口黑鲈饲料中宠物级鸡肉粉可替代部分或者全部秘鲁鱼粉。

3.2 宠物级鸡肉粉替代秘鲁鱼粉对大口黑鲈体成分和营养素沉积的影响

本研究发现，随着宠物级鸡肉粉替代比例的增加，对大口黑鲈的全鱼体成分没有显著变化，这与在海鲈[6]、乌鳢[7]和卵形鲳鲹[9]上的研究结果相似。曹晓莉等[5]报道宠物级鸡肉粉替代鱼粉对黄鳝体粗脂肪含量有显著影响，对水分、粗蛋白质和粗灰分含量没有显著影响；而易魁等[23]的研究发现，鸡肉粉替代鱼粉后使凡纳滨对虾体粗脂肪含量显著降低，对水分、粗蛋白质和粗灰分含量没有显著影响。这些差异可能与试验动物种类不同有关。

本试验中随着鸡肉粉替代比例的增加，大口黑鲈鱼体粗蛋白质沉积率和粗脂肪沉积率逐渐减少，而T4组粗灰分沉积率最高，为42.64%，饲料中粗灰分含量却是最低值，为10.31%，这可能是由于大口黑鲈沉积了饲料中的粗灰分，从而抑制大口黑鲈对蛋白质和脂肪的沉积所致。

3.3 宠物级鸡肉粉替代秘鲁鱼粉对大口黑鲈血清生化指标和抗氧化能力的影响

鱼类血液生化和抗氧化能力指标是反映鱼类生理机能及代谢状况的重要指标，也是衡量鱼类健康标准的指标[24]。本研究发现，宠物级鸡肉粉替代秘鲁鱼粉对大口黑鲈血清生化指标和总抗氧化能力均无显著影响，说明替代秘鲁鱼粉后大口黑鲈的生理和代谢状况没有受到显著影响。但是与其他学者的研究结果不同，鸡肉粉替代鱼粉后对金鲳鱼[4]、黄鳝[5]、卵形鲳鲹[9]的血清生化指标产生了显著影响，说明不同水产动物对摄食不同含量的鸡肉粉饲料后，抗应激能力反映不同，养殖品种和基础饲料配方的不同可能是引起这种差异的主要因素。

3.4 宠物级鸡肉粉替代秘鲁鱼粉对大口黑鲈肠道消化酶活性的影响

本研究发现，鸡肉粉替代秘鲁鱼粉对大口黑鲈肠道脂肪酶和胰蛋白酶活性均无显著影响，但是对淀粉酶活性产生了显著影响，这可能与鸡肉粉中的角蛋白和纤维蛋白难以消化有关；而易新文等[21]研究结果与此不同，鸡肉粉替代鱼粉对卵形鲳鲹的前肠、中肠和后肠的淀粉酶活性都没有显著影响，这与黄文庆等[25]对草鱼中肠淀粉酶活性的结果类似。这与鱼类的不同食性、生长在不同盐度的环境有关。

3.5 宠物级鸡肉粉替代秘鲁鱼粉对大口黑鲈肝脏、肠道组织结构的影响

苏木精-伊红染色技术是观察肝细胞形状、细胞核的移动以及细胞膜完整性的方法，还需要根据病变鱼数量多少来判断整体鱼群鱼体肝脏结构是否健康[26]。本试验发现鸡肉粉全部替代秘鲁鱼粉后肝细胞形状发生变化，细胞核偏向一侧，细胞界限不清，说明全部替代秘鲁鱼粉对大口黑鲈肝脏结构有一定程度的影响。

本试验发现鸡肉粉全部替代秘鲁鱼粉T5组的肠道绒毛长度最短和绒毛宽度最宽，说明肠道绒毛排列疏而短，这2个检测指标低于欧红霞[27]对大口黑鲈投喂冰鲜鱼组所测值，植物蛋白质源对大口黑鲈肠道健康研究有报道[28]，但是关于鸡肉粉替代鱼粉对水产动物肠道结构影响的研究较少报道。

4 结 论

在本试验条件下，饲料中可以添加32.5%或以下的鸡肉粉对大口黑鲈生长性能、血清生化指标没有不利影响；添加40.0%的鸡肉粉对大口黑鲈的肝脏和肠道有负面影响。