双水相萃取分离红高粱色素工艺研究

张丽，刘娜，张彦青，张彦，曹利慧

(衡水学院，河北 衡水 053000)

高粱红色素，属于黄酮类色素，含有多个酚羟基，具有特别强的抗氧化活性，可以用于食品、医药、化妆品和染色剂等领域[1-4]。双水相萃取技术是一种新型的萃取分离技术，它的优点在于所需设备简单、易于操作、传质速度快、条件较温和、分相时间较短、易于工艺放大和连续进行操作[5-9]。关晴月等[10]采用超声波法和响应面分析法对紫甘薯色素的提取工艺进行优化；姜彬等[11]采用双水相法萃取食用色素柠檬黄；王红艳等[12]以PEG/(NH4)2SO4为双水相体系对食用色素进行萃取分离，结果表明体系具有溶剂价格低廉、毒性较低、较易挥发而不需要反萃取等特点。因此，研究双水相法萃取分离高粱红色素的最佳工艺条件是非常有意义的。本文确定双水相体系，进行单因素测定，确定PEG分子量、PEG质量、(NH4)2SO4质量、水浴加热温度、粗提取液体积的最佳值。采用响应面分析法进行分析，得出萃取条件的最优值。

续 表

1 实验内容

1.1 试剂及仪器

95%乙醇(AR)、AB-8大孔树脂(AR)、PEG(1000，2000，4000，6000)、(NH4)2SO4(AR)：天津市河东区红岩试剂厂。

722G可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；TD4台式低速离心机 湖南赫西仪器装备有限公司；BL6-180A超声波清洗机 上海比朗仪器有限公司；RE-52C旋转蒸发仪 巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 高粱色素纯品的制备

取适量的AB-8大孔树脂[13-14]于带塞三角瓶中，再加入无水乙醇没过大孔树脂，在室温下密封浸泡8 h，然后用蒸馏水多次冲洗，直到AB-8大孔树脂无醇味后备用。

准确称取5 g预处理好的高粱粉末于锥形瓶中，再加入90 mL 40%乙醇和pH 9的氢氧化钠10 mL，将温度设置为50 ℃，超声提取30 min，过滤后取上清液，然后将事先处理好的AB-8大孔树脂装入洗净晾干的层析柱中，用蒸馏水水洗，缓慢加入上清液进行吸附，吸附完全后，用30%乙醇洗脱，重复以上的过程，得到纯化后的高粱色素。将纯化后的高粱色素，经旋转蒸发器蒸发出乙醇，得到纯的高粱色素固体，然后放入干燥箱中干燥至色素粉末，备用。

1.3 高粱色素波长的测定

取红高粱色素[15]精制品0.0500 g 用18 mL 40%乙醇和pH 9的氢氧化钠溶液2 mL充分混合后，用40%乙醇定容到20 mL，使用可见分光光度计测定200～800 nm范围内的吸光度。

由图1可知，波长逐渐增加，吸光度值出现先增加后减少的趋势，最高点出现在494 nm处，故最佳波长为494 nm。

图1 红高粱色素吸收光谱Fig.1 The absorption spectra of red sorghum pigment

1.4 高粱色素的标准曲线

取0.0412 g的高粱色素完全溶解于40%乙醇中，然后转移至100 mL容量瓶中，加入10 mL浓度为0.01 mol/L的NaOH溶液，用40%乙醇定容至100 mL，再用移液管移取5，10，15，20，25 mL至5个100 mL容量瓶中，用乙醇的碱溶液(乙醇与碱的比例为9∶1)定容至100 mL，在494 nm的波长下测定吸光度值。在0～100 mg/L范围内，浓度与吸光度值标准曲线的线性方程为：A=-0.00283+0.00990c，相关系数R2=0.9996。

1.5 双水相体系的确定

用移液管移取1 mL高粱红色素溶液于10 mL刻度离心管内，再加入适量的PEG和(NH4)2SO4，最后加入蒸馏水至10 g。上下摇动，使其完全溶解，放入离心机中以2000 r/min的转速离心5 min，形成双水相，上相是PEG萃取的色素相，下相为盐相，倒入分液漏斗后静置，使其上下相分离，测定上下相的体积并记录，然后在494 nm的波长下测定上下相的吸光度值，计算萃取率。

萃取率：Y=上相色素含量/总含量。

1.6 PEG种类和浓度及(NH4)2SO4浓度对色素吸光度的影响

在10 mL刻度离心管中加入1 mL的色素，分别加入5%、10%、15%、20%的PEG，或者浓度为5%、10%、15%、20%、25%、30%的(NH4)2SO4，加入蒸馏水至10 g，参比为不含色素的溶液，重复以上步骤，并分别测定不同浓度的PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000的吸光度值。在测定的范围内，PEG的分子量和浓度及(NH4)2SO4的浓度对色素的吸光度影响不大，所以可用相应的溶液作参比来消除产生的影响。

2 超声波辅助双水相萃取红高粱色素的工艺研究

2.1 聚乙二醇分子量对萃取效果的影响

在10 mL刻度离心管中加入1 mL的色素溶液，再加入不同种类的1.8 g PEG(PEG的种类分别为PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000)和1.5 g(NH4)2SO4，用蒸馏水定容至10 g，以30 ℃的温度水浴加热10 min，放入离心机中以2000 r/min的转速离心5 min，可以明显地看到，刻度离心管内分成两相，倒入分液漏斗内静置后，测定上层和下层的体积(参比液为不加色素的双水相溶液)，在494 nm的波长下测定吸光度值，代入萃取率的公式得出萃取率。

由图2可知，PEG2000的萃取率最高，所以采用PEG2000的分子量进行实验，故在下面的测定过程中选择PEG2000作为测定标准。

图2 PEG的分子量对萃取率的影响Fig.2 Effect of PEG molecular weight on the extraction yield

2.2 聚乙二醇质量对萃取效果的影响

在10 mL刻度离心管中加入1 mL的色素，再加入不同质量(1.2%、1.5%、1.8%、2.1%、2.4%)的PEG2000和1.5 g的(NH4)2SO4，用蒸馏水定容至10 g，参比为不含色素的双水相溶液，重复以上实验步骤，在494 nm的波长下测定吸光度值。

由图3可知，随着PEG2000质量逐渐增加，体系的萃取率呈现出先增加后降低的趋势，可能是质量增加过高时，PEG2000部分很难溶解，不能很好地形成双水相体系，导致萃取率降低。所以1.8 g PEG2000和1.5 g (NH4)2SO4形成的双水相萃取率最高，故在下面的测定过程中选择1.8 g PEG2000作为测定标准。

图3 PEG2000质量分数对萃取率的影响Fig.3 Effect of PEG2000 mass fraction on the extraction yield

2.3 (NH4)2SO4质量对萃取效果的影响

在10 mL刻度离心管中加入1 mL的色素，再加入质量分数1.8 g PEG2000和不同质量(1.0，1.5，2.0，2.5 g)的(NH4)2SO4，用蒸馏水定容至10 g，参比液为不含色素的双水相溶液，重复以上实验步骤，在494 nm的波长下测定吸光度值。

由图4可知，当盐的质量大于1 g时，由于盐效应的影响，PEG相变浑浊且萃取率略有降低，当质量低于1 g时，盐的浓度过低，双水相为浑浊溶液，不分层。所以选择加入质量为1.8 g的PEG2000和质量为1 g的(NH4)2SO4形成的双水相体系萃取率最高，故在下面的测定过程中选择1 g (NH4)2SO4作为测定标准。

图4 (NH4)2SO4质量对萃取率的影响Fig.4 Effect of (NH)2SO4 mass on the extraction yield

2.4 温度对萃取效果的影响

在PEG的质量为1.8 g、(NH4)2SO4的质量为1 g时，将10 mL刻度离心管放入恒温水浴锅内加热10 min，将每次的温度分别设置为20，30，40，50，60 ℃，加热10 min后取出，参比液为不含色素的双水相溶液，重复上述实验步骤，在494 nm的波长下测定吸光度值。

由图5可知，随着温度的升高，色素能更好地溶于PEG相中，但当温度超过50 ℃时，PEG相与(NH4)2SO4互溶，出现不分层现象，当温度低于20 ℃时，双水相的分层也不明显，故温度为30 ℃时萃取效果最佳。

图5 水浴温度对萃取率的影响Fig.5 Effect of water bath temperature on the extraction yield

2.5 粗提取液体积对萃取效果的影响

在10 mL刻度离心管中加入1.8 g PEG2000、1 g (NH4)2SO4，再加入不同体积的粗提取液(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL)，加蒸馏水至10 g，用不含色素体积的相同溶液做参比，重复以上实验步骤，在494 nm的波长下测定吸光度值。

由图6可知，随着粗提取液的增加，萃取率先增加后减少，当提取液的体积大于1.0 mL时，双水相萃取色素的体积有限，则没被萃取的色素残留在下层，所以萃取率降低。当提取液的体积小于0.5 mL时，双水相上下层分离不明显，原因是色素含量较低，所以粗提取液的体积为1.0 mL时萃取率最高。

图6 粗提取液体积对萃取率的影响Fig.6 Effect of crude extract volume on the extraction yield

2.6 提取条件的优化

本实验采用Design-Expert软件进行响应面的设计[16-18]。选取PEG2000的质量、(NH4)2SO4的质量、粗提取液的体积、加热温度，在上述实验结果的基础上进行响应面实验，以萃取率为响应值来设计实验，见表1。

表1 响应面实验设计方案Table 1 Response surface experimental design scheme

利用Design-Expert响应面对结果进行分析，得到以萃取率为响应值的二次回归模型:

萃取率=96.66+0.57A+0.96B+0.24C-0.012AB+0.32AC+0.16AD+0.18BC+0.46BD+0.055CD-2.49A2-2.28B2-1.41C2-4.77D2。

表2 实验设计及结果Table 2 Experimental design and results

对回归模型进行分析，由表3可知，PEG2000的质量分数和温度的影响极显著，粗提取液体积的影响显著，(NH4)2SO4质量分数的影响不显著，所以，各因素对萃取率的影响为D>B>A>C。

表3 回归方程方差分析结果Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.7 响应曲面分析

图7 色素体积和PEG2000质量对萃取率的影响

图8 色素体积和(NH4)2SO4质量对萃取率的影响

图9 色素体积和温度对萃取率的影响

图10 (NH4)2SO4质量和PEG2000质量对萃取率的影响

图11 温度和PEG2000质量对萃取率的影响

图12 (NH4)2SO4质量和温度对萃取率的影响

上述三维空间曲面图考察了交互项对萃取率的影响，再用Design-Expert软件进行回归分析的优化，可以得出高粱色素的最佳条件：色素体积为1.03 mL，PEG2000质量为1.85 g，(NH4)2SO4质量为1.02 g，水浴加热温度为30.82 ℃，加蒸馏水定量至10 g。考虑到实际操作的可能性，将其变更为：色素体积为1.00 mL，PEG2000质量为1.8 g，(NH4)2SO4质量为1 g，水浴加热温度为30.00 ℃，加蒸馏水定量至10 g。用该条件进行验证，得出该模型的萃取率为98.25%，结果合理有效，可以应用于实际中。

3 结论

采用双水相法萃取分离红高粱色素，首先纯化粗提取的红高粱色素，制作相应的标准曲线，确定回归方程。然后确定494 nm为其最大吸收波长，通过查阅资料确定双水相体系的组成为PEG/(NH4)2SO4，考察PEG分子量、PEG质量分数、(NH4)2SO4质量分数、水浴加热温度、粗提取液的体积对色素萃取率的影响，由此建立的多项回归方程能较好地反映实际情况的萃取，得到最佳的萃取效果是：1.8 g的PEG2000，1 g的(NH4)2SO4，水浴加热温度为30 ℃，加入粗提取液1 mL，加蒸馏水定量至10 时，红高粱色素的萃取效果最佳，为98.25%。