低温胁迫下冬油菜陇油7号根部代谢组学分析

方 彦，曾秀存，马 骊，孙柏林，武军艳，董 云,3，刘丽君，金姣姣，孙万仓，李学才

(1. 甘肃省干旱生境作物学重点实验室, 甘肃 兰州 730070; 2. 甘肃省油菜工程技术研究中心, 甘肃 兰州 730070;3. 甘肃省农业科学院作物研究所, 甘肃 兰州 730070 4. 河西学院农业与生物技术学院, 甘肃 张掖734000)

低温逆境严重影响植物的生长和生产力。植物在一段时间的低温锻炼下可以获得更高的抗冻能力[1]，在这一高度复杂的过程中，植物形态、分子、生化和生理均发生变化[2], 最终表现为与低温胁迫相关的基因表达水平发生显著变化，并重新调整代谢水平[3-4]。寒冷对植物的初生和次生代谢具有重要的调节作用[5]。植物在受到低温等非生物胁迫之后，体内的代谢平衡被打破，为了抵御胁迫产生的伤害，植物通过信号转导系统诱导合成抗逆相关的代谢产物，以修复损伤或达到新的代谢平衡[6]。在外界环境发生变化时，不同植物的代谢产物不同，同一植物不同器官或不同的发育时期代谢产物也有一定的差异。代谢物是基因型与表型之间的桥梁，代谢物的变化更能直接揭示基因的功能，因此能够更有效地揭示生物学及其生化和分子机制。代谢组学已经被广泛运用于逆境胁迫研究中[7-8]。拟南芥在冷胁迫应答过程中代谢组会发生明显的变化[9]。低温环境下的鼠耳芥属植物的代谢指纹分析鉴定出了一系列已知和未知的与低温相关的小分子代谢产物[10]。 Maruyama等[11]对拟南芥的冷处理材料利用液相色谱-离子阱质谱分析法检测发现，次级代谢产物数量明显下降，许多种单糖、二糖、三糖和糖醇会大量积累。Kaplan等[10]利用代谢组对拟南芥在低温驯化下代谢变化进行分析，发现低温胁迫诱发广泛的代谢响应。 此外，研究还发现抗寒能力不同的两种基因型水稻在冷胁迫下可溶性糖类的积累是不同的[12]。

北方旱寒区冬油菜秋季播种，次年春季返青，冬季极端低温限制了不同抗寒性冬油菜能否安全越冬。因此，强抗寒性是其适应北方寒冷环境而生存的前提。本课题组对低温胁迫下陇油7号的形态特征[13]、生理生化[14]、抗寒响应的相关基因[15]和蛋白质组学[16]等进行了研究，但对冬油菜通过自身代谢调控来缓解伤害适应胁迫的系统研究还少见报道。在植物细胞中，许多代谢中间产物是调节细胞渗透势的重要组分，而这些代谢物质含量的变化可能在植物代谢与生理反应中起十分重要的作用。通过广泛靶向代谢组分析可以对特定的生理、生长发育等表型中时序表达差异积累的代谢物信息进行分析。根是北方旱寒区冬油菜越冬期唯一存活的器官，根部抵御低温能力的强弱是决定冬油菜能否安全越冬的关键。因此，本试验选择超强抗寒白菜型冬油菜品种陇油7号为材料，对低温胁迫下根部进行非靶向代谢组分析，为深入探讨其越冬期的代谢变化提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

超强抗寒性白菜型冬油菜品种陇油7号种子由甘肃省油菜工程技术研究中心提供。将种子播于营养钵培养，每钵留苗4株，待幼苗长至 5～6片真叶进行处理。一组放入22℃培养箱(12 h光照/12 h 黑暗)平衡48 h后取根(CK)；为适应零度以下低温处理，另一组降温至4℃和0℃分别保持48 h(降温速率2℃·h-1)，最后，以同样的降温速率降温至-4℃保持 6 h(CT)，取根，液氮速冻后置于-80℃冰箱备用。每份样品由在相同生长条件下的6株油菜组成，代谢组分析6个生物学重复。

1.2 实验仪器与试剂

1290超高压液相色谱仪(Agilent，美国)、 Triple TOF 5600高分辨质谱仪(AB Sciex，美国)；ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱 (美国，Waters，1.7 μm × 2.1 mm×100 mm)；PS-60AL型超声仪(深圳市雷德邦电子有限公司)，甲醇、乙腈、醋酸铵和氨水均为德国CNW公司LC-MS级。

1.3 代谢物提取

样品放入预冷的研钵中，加液氮研磨至粉末状。称取50 mg粉末样品置于2 mL EP管中，加入1 000 μL提取液(甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1)，再加入20 μL 内标L-2-氯苯丙氨酸，涡旋混匀30 s；放入钢珠，45 Hz研磨仪处理4 min，冰水浴超声5 min(重复3遍)；-20℃静置1 h；4℃，12 000 r·min-1离心15 min；移取600 μL上清液于EP管中，真空浓缩后加入200 μL 提取液(乙腈∶水=1∶1)复溶；涡旋30 s，冰水浴超声10 min后将样品4℃、12 000 r·min-1离心15 min；取60 μL上清液于2 mL进样瓶。每个样本各取10 μL混合成质控样本。

1.4 代谢物检测

参考文献[17]、[18]方法检测代谢物。流动相A为水(25 mM醋酸铵及25 mM氨水)，B为100%乙腈，洗脱梯度：0～0.5 min,95%B；0.5～7 min,95%B～65%B；7～8 min,65%B～40%B；8～9 min,40%B；9～9.1 min,40%B～95%B；9.1～12 min,95%B。进样体积为1 μL。

1.5 质谱条件

AB 5600 Triple TOF质谱仪在控制软件(Analyst TF 1.7, AB Sciex)控制下基于IDA功能进行一级、二级质谱数据采集。分别采用正、负离子模式采集。在每个数据采集循环中，筛选出强度最强且大于100的分子离子进行采集对应的二级质谱数据。轰击能量：30 eV，15张二级谱图每50 ms。ESI离子源参数设置：雾化气压(GS1)，60 Psi；辅助气压，60 Psi；气帘气压，35 Psi；温度，650℃；喷雾电压，5 000 V(正离子模式)或-4 000 V(负离子模式)。

1.6 数据处理

参照文献[19]方法进行数据处理。使用ProteoWizard软件将质谱原始数据转成mzXML格式，再使用XCMS(version 3.2)进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等处理。物质鉴定的数据处理及匹配：使用百迈客生物有限公司基于XCMS开发的程序及自建库进行处理，minfrac设为0.5，cutoff设为0.8。采取t检验(Student’st-test)的P值与正交偏最小二乘法-判别分析(Orthogonal projections to latent structures- discriminant analysis, OPLS-DA)模型的VIP(Variable importance in the projection)值相结合的方法来筛选差异代谢物，筛选的标准为VIP>1，且显著性达到P<0.05。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫下陇油7号OPLS-DA分析

利用OPLS-DA方法，将低温处理后的处理组和常温对照组陇油7号根部共12个样品的标准数据进行分析(图1)。从图1可以看出，样品处理组和对照组6个生物学重复的数据点检测结果均很好地分成两组，并分别集中在一起。OPLS-DA分析方法评价模型的预测参数有R2X，R2Y和Q2，其中R2X和R2Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q2表示模型的预测能力，这3个指标越接近于1时表示模型越稳定可靠，Q2> 0.5时可认为是有效的模型[20]。本研究模型的评价参数R2X，R2Y和Q2分别为0.588、0.989和0.608，参数均超过0.5，说明本试验建立的OPLS-DA模型可为后续的数据分析提供支持。

注：X1-4,X1-5,X1-6,X1-7,X1-8,X1-9为22℃ 处理6个生物学重复；X5-4,X5-5,X5-6,X5-7,X5-8,X5-9为-4℃处理下6个生物学重复。Note: X1-4,X1-5,X1-6,X1-7,X1-8,X1-9： 6 biological replicates at 22℃；X5-4,X5-5,X5-6,X5-7,X5-8,X5-9：6 biological replicates at -4℃.图1 陇油7号低温处理与常温对照正交偏最小二乘法-判别分析得分Fig.1 OPLS-DA score plots of two groups of samples

2.2 低温胁迫下冬油菜陇油7号根部差异代谢物的筛选及KEGG富集分析

通过火山图可以快速地查看代谢物在两个组中表达水平的差异，以及差异的统计学显著性。图2为陇油7号根部差异表达火山图。

图2 陇油7号低温处理与常温对照差异代谢物筛选火山图Fig.2 The volcano plot for two groups of samples

低温处理组较对照组在正离子模式下上调代谢物116个，下调代谢物96个。在标准谱库进行对比分析后，确定了124个代谢产物的结构；在负离子模式下上调代谢物122个，下调代谢物39个。在标准谱库鉴定到101个代谢物。

KEGG富集分析结果显示(图3)，在正离子模式下，代谢物主要富集到果糖和甘露糖代谢、醚脂类代谢、花生四烯酸代谢、苯丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢、半乳糖代谢、α-亚麻酸代谢、氨基酸生物合成和亚油酸代谢等20个通路中；在负离子模式下，代谢物主要富集到淀粉和蔗糖代谢、果糖和甘露糖代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、半乳糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等10个通路。这些代谢通路可能与陇油7号抗寒代谢途径有关。

注：A—正离子模式，B—负离子模式。Note: A — positive ion mode；B — negative ion mode.图3 陇油7号低温处理与常温对照差异代谢物KEGG富集Fig.3 Enrichment plot for two groups of samples

2.3 低温胁迫处理后冬油菜陇油7号根部差异代谢物的鉴定结果

根据VIP>1且P<0.05筛选条件下的OPLS-DA结果，陇油7号根部共有225个已知代谢产物在低温和常温条件下有较大差异。对鉴定到的8种糖代谢相关产物、4种氨基酸类、甘油磷酰胆碱、黄酮、6种磷脂进一步分析(表1)，各类成分在低温处理后上下调模式不同。低温促进糖(除鼠李糖外)、黄酮、赖氨酸-缬氨酸、脯氨酸-色氨酸的积累。磷脂的变化存在差异，与对照相比，低温下磷脂酰胆碱(PC)类(除o-16∶0/18∶0亚类外)上调，脂酰乙醇胺(PE)类和磷脂酰丝氨酸(PS)类下调，而磷脂酰肌醇(PI)类、磷脂酸(PA)类及磷脂酰甘油(PG)类的变化因亚类而异。

表1 低温胁迫条件下陇油7号根部差异代谢物比较

3 讨 论

3.1 陇油7号在低温条件下调节糖和氨基酸代谢水平适应环境

植物在遭受非生物胁迫时可产生脯氨酸、甜菜碱和可溶性糖等渗透调节物质抵御外界压力损伤[21]。低温严重影响植物的生长和发育，在长期的抗寒锻炼中，植物获取了不同适应低温胁迫的能力。有些植物在低温逆境胁迫时通过改变蔗糖及其衍生物寡糖的含量适应不利环境，蔗糖的积累能显著降低植物的冰点，增强细胞的保水力[22]。低温条件下，葡萄藤会积累更多的海藻糖[23]，葡萄藤花序在冷处理下蔗糖含量更丰富[24]。拟南芥植株响应冷胁迫的代谢研究结果表明，葡萄糖、果糖和棉子糖等糖类对温度胁迫具有重要作用[25]。植物组织中的氨基酸能对冷胁迫做出响应，特别是脯氨酸水平增加是抗冷机制之一[26]。陇油7号根系低温处理后与对照相比，KEGG分析代谢物主要富集到果糖和甘露糖代谢、淀粉和蔗糖代谢途径及氨基酸生物合成通路。甘露糖、塔罗糖、阿洛糖、蔗糖、海藻糖和棉子糖6种糖类差异倍数均在1.2以上，赖氨酸-缬氨酸和脯氨酸-色氨酸含量提高。表明低温胁迫下，含有氨基酸和糖类物质的代谢网络对低温胁迫具有重要作用，冬油菜可主动积累体内糖类和氨基酸类渗透调节物质，提高细胞液浓度，维持渗透压，保护膜系统组分，提高抗寒性。

3.2 磷脂类代谢物质对陇油7号抗寒性具有重要作用

植物细胞膜是所有细胞结构和功能的组成部分，是细胞与外界环境联系的直接界面，对环境变化非常敏感[27]。前人在细胞膜对温度变化的响应方面做了大量的研究，结果表明，低温诱导首先引起植物膜损伤[28-30]。磷脂是生物膜的主要组成成分。磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)及磷脂酰甘油(PG)是植物中主要的磷脂分子。Uemura等[31]研究发现拟南芥在低温处理后，磷脂的比例有增加的趋势。PC是可提高膜稳定性的双层脂质，而PE更倾向于过渡到非双层结构[32],PG分子水平与植物的冷敏感性呈正相关[33],PI在应激反应中发挥重要作用[34]。PA是一类最重要的磷脂信使物质，参与多种逆境与激素的信息传递过程[35]。本研究在陇油7号根部检测出6类磷脂，在低温处理后其中PC亚类上调， PE和PS下调，PG、PI和PA亚类部分上调，部分下调。研究表明，不同磷脂种类之间的转换对细胞膜稳定性有一定影响[36]。冷冻胁迫诱导各种膜磷脂的降解和转化以及酰基链不饱和度的变化等[37]，植物更偏好脂质重组适应温度变化[38]。低温胁迫下，陇油7号可调节根部磷脂代谢，维持细胞膜的稳定性，免受低温胁迫的危害。

4 结 论

本试验基于非靶向代谢组技术的研究方法，对强抗寒性冬油菜品种陇油7号根系在低温胁迫处理后的代谢产物进行了分离与鉴定。糖类、氨基酸、甘油磷酰胆碱、黄酮、6种磷脂(PG、PC、PE、PI、PS和 PA)等均得到鉴定。低温胁迫下，糖、赖氨酸-缬氨酸、脯氨酸-色氨酸积累，磷脂中PC增加，PE和PS下降， PI、PA和PG类的变化因亚类而异。陇油7号在低温条件下调节糖、氨基酸和磷脂类代谢水平适应环境。研究结果为冬油菜抗寒相关物质代谢深入研究奠定基础。