恒温微流控系统检测及鉴定结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的应用价值

王泉 马瑞瑛 杨婷 张亚丽 许苗 撒玉玲 陈清波

结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)与非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)临床上引起的疾病难以区别，在无菌种鉴定情况下NTM病经常被误诊为结核病，而两者治疗方案明显不同[1-2]。因此，快速准确地鉴定MTBC与NTM对结核病的早期诊断、早期治疗，以及对疾病防控均具有重要意义。传统的区分MTBC与NTM方法主要依靠培养法结合对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)生长试验，但培养法耗时较长。恒温微流控芯片检测系统集等温扩增与产物检测一体化，具有操作简单、耗时短等优势；且其多样本和多重检测等功能可极大简化操作流程，降低了对实验人员要求，适于基层地区开展[3-4]。笔者利用恒温微流控芯片技术检测痰液标本中MTBC与NTM，并与分枝杆菌传统培养法和PNB/TCH生长试验进行对比，以评价其应用价值。

材料和方法

一、菌株来源

采用前瞻性研究方法，收集新疆医科大学第八附属医院2018年9月至2019年12月间经抗酸染色镜检阳性的痰液标本，共624份。

二、仪器和试剂

1.仪器：恒温扩增微流控芯片核酸分析仪、MTB-NTM微流控芯片由广州迪澳生物科技有限公司提供，设备可进行4块芯片反应，每块芯片可同时进行4份样本的MTB与NTM区分鉴定。

2.试剂：萋-尼染色液、酸性改良罗氏培养基(珠海贝索生物技术有限公司)；DNA提取液(广州迪澳生物科技有限公司)。

三、实验方法

1.罗氏固体培养和PNB/TCH生长试验菌种鉴定：将收集合格的3 ml痰液标本中加入2倍体积4%的氢氧化钠溶液后涡旋振荡混匀，静置15 min。以无菌吸管吸取处理后的痰标本(约1 ml)均匀接种至酸性改良罗氏培养基斜面上，每支培养基接种2滴(0.1～0.15 ml)。将接种后的培养基连同斜面培养架置于恒温培养箱内，(36±1) ℃孵育。24 h后再拧紧培养管螺旋盖放置于直立的培养架上，(36±1) ℃继续孵育。将PNB用二甲基甲酰胺溶解稀释后加入未凝固的改良罗氏培养基中，最终浓度控制在0.5 mg/ml；TCH用灭菌蒸馏水溶解，培养基中最终浓度为5 μg/ml。PNB/TCH生长试验按照《结核病实验室检验规程》进行。

2.核酸模板提取：另取1 ml液化后痰标本加入离心管，10 000×g离心5 min，弃上清液，加入100 μl的DNA提取液，100 ℃加热10 min冷却至室温，10 000×g离心2 min，将上清液转移至新的离心管中备用。

3. 恒温微流控系统检测：分别针对分枝杆菌复合群(16S rRNA)及MTBC(IS6110)特异性核酸片段设计恒温引物，并采用引物预包埋技术将其固定至微流控芯片。将提取上清液及恒温反应液5 μl(按照每个反应腔室0.2 μl上清液及2.3 μl恒温反应液混合)均分至各反应腔，芯片置于核酸恒温分析仪中，63 ℃反应45 min。采用实时荧光曲线对结果进行判读，当呈现“S”型扩增曲线时该反应腔室核酸检测结果为阳性，无“S”型扩增曲线则结果为阴性。若16S rRNA和IS6110检测结果均为阳性，则鉴定结果为MTB；若16S rRNA检测结果为阳性，IS6110检测结果为阴性，则鉴定为NTM；若16S rRNA和IS6110检测结果均为阴性，则鉴定结果为非分枝杆菌。

4. 二代测序技术：对于微流控检测系统和PNB及TCH实验检测结果不一致的标本，将样本核酸交给深圳华大基因公司进行DNA序列测定，使用华大基因研制的专利产品试剂盒中的引物作为测序上下游引物，测序仪器型号为BGISEQ-500。

四、统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计数资料以“百分率(%)”表示，组间差异的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。以罗氏固体培养和PNB/TCH生长试验菌种鉴定结果为参照，评价恒温微流控系统检测分枝杆菌和鉴定菌种的效能，各指标计算公式如下：敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；一致率=(真阳性例数+真阴性例数)/总例数×100%。各方法间的一致性检验采用Kappa检验，Kappa值≥0.75，说明一致性较好；0.4≤Kappa值<0.75，说明一致性一般；Kappa值<0.4，说明一致性较差。

结 果

一、分枝杆菌检测结果

624份痰标本中，经罗氏固体培养法检测阳性612份(98.1%)，其中，515份(82.5%，515/624)经PNB/TCH生长试验菌种鉴定为MTB，97份(15.5%，97/624)鉴定为NTM。恒温微流控系统检测阳性607份(97.3%)，其中，513份(82.2%，513/624)鉴定为MTB，94份(15.1%)鉴定为NTM。恒温微流控系统和传统培养法分枝杆菌阳性检出率比较，差异无统计学意义(χ2=0.021，P=0.950)。

二、检测效能分析

以罗氏固体培养法检测结果作为参照标准，恒温微流控系统检测抗酸染色镜检阳性的痰液标本中分枝杆菌的敏感度和特异度分别为99.2%(607/612)和100.0%(12/12)，Kappa值为0.82，见表1。

表1 恒温微流控系统以痰培养结果为参照标准检测痰液标本分枝杆菌的效能

以PNB/TCH生长试验结果作为参照标准，恒温微流控系统检测痰液标本中MTBC的敏感度和特异度分别为99.6%和100.0%，Kappa值为0.99，见表2。恒温微流控系统检测痰液标本中NTM的敏感度和特异度分别为96.9%和100.0%，Kappa值为0.98，见表3。

表2 恒温微流控系统以PNB/TCH生长试验鉴定结果为参照标准检测MTBC的效能

表3 恒温微流控系统以PNB/TCH生长试验鉴定结果为参照标准检测NTM的效能

三、方法间差异性分析

5份分枝杆菌培养阳性而恒温微流控系统检测为阴性的标本，经PNB/TCH生长试验鉴定，2份为MTBC，3份为NTM。经测序，2份MTBC标本得到确证；3份NTM标本中1份为偶发分枝杆菌，2份为诺卡菌。

讨 论

传统的MTBC与NTM的区分采用培养法结合PNB/TCH生长试验，耗时较长(约2～6周)[5]。恒温微流控系统可实现对4份标本多指标同时检测，从进样到结果判读仅需1 h，同传统方法相比有效缩短了检测和鉴定时间。另外，反应在恒温条件下即可进行，对设备的要求相对较低；蝶式微流控芯片使用普通聚乙烯材料制作，采用离心进样方式可有效降低检测成本，进一步降低了患者的医疗负担，适合于现场和基层单位应用。

本研究利用基于核酸等温扩增技术开发的微流控芯片与设备对624份抗酸染色镜检阳性的痰液标本进行检测，同时采用罗氏固体培养法和PNB/TCH生长试验菌种鉴定进行对比，探讨该技术检测分枝杆菌和鉴定MTBC与NTM的应用价值。研究发现，培养法分枝杆菌阳性检出率为98.1%，恒温微流控系统阳性检出率为97.3%，差异无统计学意义。以改良罗氏固体培养法结果为参照，恒温微流控系统检测分枝杆菌具有较高的敏感度(99.2%)和特异度(100.0%)，能直接区分分枝杆菌与其他呼吸道致病菌感染；Kappa值为0.82，表明该方法与培养法检测结果一致性较好，具有较高的检测效能，适用于临床标本分枝杆菌感染初筛。王桂荣等[6]利用多重PCR技术检测MTB和NTM临床分离株的敏感度分别为99.36%和98.00%；特异度分别为99.32%和98.00%。可见，该方法具有较高的检测敏感度和特异度，但其结果判读采用琼脂糖凝胶电泳，导致其临床应用价值较低。张洁等[7]研究显示，与传统培养法和菌种鉴定方法相比，实时荧光PCR检测MTBC的敏感度为99.0%，检测NTM的敏感度为75.4%，总符合率为99.0%。本研究显示，以PNB/TCH生长试验菌种鉴定结果为参照，恒温微流控系统鉴定MTBC与NTM的敏感度分别为99.6%和96.9%，Kappa值分别为0.99与0.98，说明以核酸扩增为基础的恒温微流控系统适用于痰液标本中MTBC与NTM的鉴定。

此外，本研究中有5份分枝杆菌培养阳性而恒温微流控系统检测为阴性的标本，测序结果显示2份为MTB，1份为偶发分枝杆菌。恒温微流控系统检测为阴性的原因是当痰标本中分枝杆菌分布较为集中时，分配给待考评检测体系的标本可能不含菌或含菌量低于或接近待反应体系的最低检出限，导致其结果为阴性。2份标本经PNB/TCH生长试验鉴定为NTM，而测序结果为诺卡菌，可能是培养过程中污染所致。王建等[5]对2175株分枝杆菌进行PNB/TCH生长试验，初步鉴定的93株NTM有14株为假阳性，与本研究的现象类似。这说明以培养法为参照标准在鉴定NTM时存在一定不足，以核酸检测为基础的筛查结果相对可靠。

综上所述，本研究结果证实，恒温微流控系统在以抗酸染色镜检阳性为诊断基础时，鉴定痰液标本中MTBC与NTM具有较好的性能。这为该方法的普及提供了有力的证据。当然，本研究也存在一定的不足：(1)无法对菌株耐药情况进行检测；(2)NTM 因菌种差异而导致临床用药也不相同，本检测系统无法对NTM临床分离株进行菌种鉴定。