猪场废水中抑菌物质的识别及其对自养型同步脱氮颗粒污泥活性的影响

郭 露，夏 珂，王 兰，邓明刚，何 婷，邓良伟

(1.华中农业大学 生命科学技术学院，湖北 武汉 430070；2.农业农村部沼气科学研究所，四川 成都 610041；3.山西农业大学生命科学学院，山西 晋中 030620)

随着生猪养殖业规模化发展，大量猪场粪污集中产生，给当地造成了较大环境压力。厌氧消化不仅能够消减猪场粪污中的有机物，而且还产生清洁能源—甲烷，可为粪污处理产生经济价值[1]。但是，猪场粪污厌氧消化后残余的厌氧消化液(沼液)中氨氮含量仍然较高，资源化还田利用是沼液最佳处置方法。由于在土地紧张地区，沼液难以完全还田利用，因此，如何为数量巨大的猪场粪污寻找经济有效的处理、处置方法，已经成为规模猪场亟需解决的问题。目前，难以还田的沼液只能达标处理以后排入附近水体，脱氮是达标处理主要目标[2]。

传统硝化-反硝化工艺需大量易降解有机物作为碳源[3]，而猪场粪污在沼气发酵技术回收能源后，厌氧消化液中有机物含量低，无法满足硝化-反硝化工艺的碳源需求，使得其脱氮效能低、能耗高[4]。自养型同步脱氮(autotrophic nitrogen removal，ANR)工艺是以自养型好氧氨氧化菌(Ammonia-oxidizing microorganisms，AOM)和自养型厌氧氨氧化菌(Anammox菌)为主要功能微生物的脱氮工艺，其中AOM细菌将氨氧化为亚硝氮，而Anammox菌将剩余的氨氮和亚硝氮同时转化成氮气，达到废水自养生物脱氮作用[5]。该工艺全程自养无需外加碳源，能有效减少曝气能耗和外加碳源成本，是一种具有广阔前景的自养生物脱氮技术，对于处理猪场厌氧消化液等低碳氮比废水具有明显优势。自养型同步脱氮工艺以颗粒污泥(ANR颗粒污泥)为主体，以往的研究主要以模拟废水作为进水。大量研究表明，猪场粪污成分复杂，含有模拟废水所没有的大量抑菌物质，包括高浓度的抗生素[6]、重金属[7]、高浓度的无机盐类、激素类[8]物质等，这些抑菌物质可能给自养型同步脱氮工艺的稳定运行带来巨大障碍。

已有研究表明，存在大量有机物的情况下，厌氧氨氧化细菌和反硝化细菌的竞争下处于劣势，主要原因是有机物利于异养反硝化细菌的生长，而厌氧氨氧化细菌作为化能自养型细菌处于不利地位[9-10]。但在外部有AOM保护的情况下，有机物是否可对ANR颗粒污泥产生影响，目前尚不完全清楚。除此之外，一系列研究表明，Cu2+[11-12],Pb2+,Hg2+,Cd2+,Ag2+[13],Co2+,Zn2+,Mn2+,Ni2+[14]等金属离子对废水处理中的微生物菌群具有不利影响，可能会降低废水处理效能。微量的某些金属离子是某些酶和辅酶的重要组成部分，能够促进微生物的活性，而过量重金属离子的存在对微生物的生长代谢和繁殖具有较强毒性[15]。但其是否可对微生态较稳定的ANR颗粒污泥产生影响，目前尚未见报道。随着非洲猪瘟疫情爆发[16]，作为猪场常用消毒剂主要成分之一的戊二醛使用量激增，残留的戊二醛随猪场冲洗水一同汇入猪场废水中。戊二醛在杀灭病原菌的同时，也可能对废水生物处理系统中的功能微生物产生毒性，继而干扰污水处理系统性能[17]。但经厌氧消化和一系列废水处理以后，戊二醛是否仍存在残留，其对ANR颗粒污泥是否产生影响，目前尚未见报道。

因此，本研究通过对20个不同地区或不同处理阶段猪场废水的特性、重金属以及戊二醛含量的检测，解析了猪场废水中抑菌物质的存在状况，进而分析了有机物、戊二醛以及Cu2+对ANR颗粒污泥中主要脱氮微生物活性的影响，以期弄清ANR工艺运用于猪场废水脱氮过程中可能存在的抑制问题，为自养型同步脱氮工艺在猪场废水处理过程中的稳定运行奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 不同猪场废水的取样

分别取20个不同猪场不同处理阶段的废水样品，取样后用冰袋保存寄送至实验室，保存于-20℃冰箱，以备后续实验使用。

1.2 抑菌物质对ANR颗粒污泥中主要脱氮微生物菌群的影响

1.2.1 活性试验

本课题组的前期研究表明，AOM和Anammox细菌为ANR颗粒污泥的主要功能微生物[5]。因此，本研究分别测定不同浓度Cu2+和有机物浓度(葡萄糖，以COD计)、戊二醛对ANR颗粒污泥主要功能微生物活性的影响，包括好氧氨氧化菌(AOM)氨氧化活性、亚硝酸盐氧化菌(NOB)亚硝酸盐氧化活性和Anammox细菌的厌氧氨氧化活性、异养反硝化菌(DB)的反硝化活性。其中AOM,NOB,Anammox活性试验参考Wang[18]等的方法进行。

1.2.2 戊二醛对ANR颗粒污泥形态特性的影响

取5 g ANR颗粒污泥于100mL血清瓶，加入100mL模拟废水，分别加入一定量戊二醛储备液，使得瓶内戊二醛终浓度为0,10,30,50 mg·L-1，在150 rpm，30℃条件下培养48 h后取上清液，过0.45 μm滤膜，使用蒽酮-硫酸法检测其中的多糖含量[19]；取污泥沉淀物，使用QICPIC粒度仪(Sympatec GmbH，德国)测试污泥颗粒粒径分布和粒径相关参数。

1.3 废水中抑菌物质及常规水质指标检测方法

1.3.1 重金属的检测方法

Cu，Pb，Ni，Fe，Zn和Cd采用原子吸收分光光度计法进行测定(PinAAcle900T，Perkin Elmer，美国)，As采用原子荧光光度计法进行测定(AFS-922，北京吉天仪器，中国)，检测方法主要参照《水质铜、锌、铅、镉的测定原子吸收分光光度法》(GB7475-1987)，《土壤质量铅、镉的测定石墨炉原子吸收分光光度法》(GB/T 17141-1997)和《食品安全国家标准 食品中镍的测定》(GB 5009.138-2017)。

1.3.2 戊二醛的检测方法

猪场废水样品中戊二醛含量使用液相色谱质谱联用仪(LCMS-IT-TOF，岛津，日本)进行检测，采用电喷雾法进行样品的离子化，扫描范围：50～200 m/z；电离电压：4.50 kV；界面温度：250℃；喷雾器气体(N2)流量：90 L·h-1；检测器电压：1.60 kV；采用连续模式进行检测。

1.3.3 常规水质指标测定

pH值使用pH计(PHS-3E，雷磁，中国)进行测定；氨氮采用纳氏试剂分光光度法测定，亚硝氮采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定，硝氮采用紫外分光光度法测定；COD使用COD快速测定仪(LH-3C，连华科技，中国)进行测定；溶解氧(DO)浓度使用便携式溶解氧仪(HQ30d, 哈希,美国)进行测定；VSS采用重量法测定。

2 结果与讨论

2.1 不同猪场废水的基本特性

从表1可以看出，各猪场废水在各个阶段的pH值都处在一个中性偏碱性的范围内(7.0～9.3),该范围恰好也在AOM和Anammox细菌的最适pH范围内[20-21]，因此猪场废水的pH值适合ANR颗粒污泥的生长与代谢。氨氮是ANR颗粒污泥的主要基质，在猪场废水中，原水和沼液的氨氮浓度分别为1364±634和1293±546 mg·L-1。研究表明，AOM对NH3的半饱和常数和抑制浓度分别为0.0102～2.69 mg·L-1和6800 mg·L-1[22-23]；而Anammox细菌对NH3的亲和力常数和抑制浓度分别小于0.1 mg N·L-1和大于1000 mg N·L-1[24]。可见，猪场废水的氨氮浓度也是适宜ANR工艺的。

根据清粪工艺的不同，猪场废水原水中COD浓度差异较大，在3154～50860 mg·L-1之间；经过厌氧消化以后，沼液COD浓度大幅削减，为2254±1773 mg·L-1(见表1)。研究表明，高浓度的非毒性有机物会抑制Anammox的活性，而低浓度的有机物甚至会促进Anammox反应器的效能[21]。这主要是由于，高浓度的有机物有助于异养微生物的生长，而异养微生物比自养微生物生长快速，从而对自养的Anammox细菌产生竞争性抑制；另一方面，有研究表明，Anammox细菌具有代谢多样性，在高浓度有机物的情况下，其更倾向于利用有机物产生能量，而非氨和亚硝酸盐，从而降低其脱氮活性[25-27]。同时，Li[28]等的研究也表明，100 mg·L-1COD浓度下，氨氮和总氮去除率大于90%，而当COD浓度增加到300 mg·L-1时，厌氧氨氧化的脱氮效能降低到69%。此外，过量的有机物对厌氧氨氧化颗粒污泥的EPS分布和微生物结构也有影响[29]。由此推测，过高的有机物浓度可能成为ANR颗粒污泥的脱氮抑制因子之一。

表1 20个猪场废水样品基本特性

2.2 猪场废水中重金属含量的分布

本研究分析了上述20个猪场废水的主要重金属含量(见表2)。结果表明，铁离子在猪场废水中大量存在，含量较高，除了眉山某猪场的好氧出水(本身含量低)以及简阳某猪场的超滤和反渗透出水(膜过滤作用去除)外，其余废水均在1.49～131 mg·L-1浓度范围内，其中沼液中为30.1±47.6 mg·L-1。但是从目前的研究来看，铁离子的存在对微生物的脱氮是有利的，它的存在可以促进微生物之间的凝聚作用[30]。而铅和镍在20个不同的猪场废水中只有个别样品检出且含量极低(检出铅和镍的浓度分别为0.0077±0.024 mg·L-1，0.058±0.063 mg·L-1)，作为ANR颗粒污泥脱氮抑菌因子来研究不具有代表性。镍的含量在各废水样品中都处于较低水平，均在1 mg·L-1以下，而孙琪[31]等人的研究表明，在这个浓度水平下镍离子对厌氧氨氧化几乎没有影响。砷在不同地区猪场废水中的浓度差异较大，为0.011～35.5 μg·L-1，这可能跟地区土壤砷存在的环境背景相关。Zn几乎在所有的猪场废水中均存在，其中在原水、沼液、好氧出水和终水(絮凝出水或超滤出水)中的浓度分别为14.1，15.3，4.85，0.120 mg·L-1，可见，随着猪场废水的处理，一部分的Zn2+可随污泥或者膜浓缩液排出。Cu2+在大部分的猪场废水中也存在，其中在沼液中的含量为2.23 mg·L-1左右。从重金属的角度来看，Zn2+和Cu2+在猪场废水中含量较高，有可能成为ANR颗粒污泥脱氮抑制因子。尽管Zn2+在猪场废水中的浓度大于Cu2+,但是，据Kimura[32]等人的研究，当锌离子的添加量达到10 mg·L-1时，厌氧氨氧化活性仅下降14%，Zn2+的半抑制浓度为12.5 mg·L-1，而同实验中，Cu2+的半抑制浓度为6.50 mg·L-1。这表明ANR工艺的主要功能菌群厌氧氨氧化细菌对Cu2+比对Zn2+要更加敏感。据以上分析，重金属离子中Cu2+成为导致ANR颗粒污泥抑制因子的可能性更高。

表2 20个猪场废水样品中重金属含量

2.3 猪场废水中戊二醛含量的检测

受非洲猪瘟的影响，各猪场均加大了消毒剂的使用量，而戊二醛是主要猪场消毒剂。为探究猪场废水中戊二醛残余含量的存在情况，本研究利用质谱法检测了简阳某猪场原水和沼液中戊二醛的含量。结果表明(见图1～图3)，在猪场废水的原水和沼液中均可以成功检测到戊二醛及其中间代谢产物戊二醇和戊二酸。由于戊二醛在好氧条件下易被氧化为戊二酸；在厌氧条件下，易被还原为1,5-戊二醇[33]；因此，在本研究的质谱峰中除了能找到小部分戊二醛的特征峰，还能找到较多戊二醇和戊二酸的特征峰。可见，由于大量戊二醛消毒剂的使用，导致在猪场废水及沼液中仍可检出戊二醛，但是其以本体形式单独存在的比例较小，大部分都在厌氧消化阶段还原为戊二醇或在好氧阶段氧化为戊二酸，尽管如此，已有研究表明，低浓度的戊二醛仍对水体微生物存在显著抑制，可使细菌活菌数下降97.5%[33]；因此戊二醛仍有可能是ANR颗粒污泥的抑制因子之一。

图1 戊二醛标品品质谱图

图2 简阳某猪场原水样品质谱图

图3 简阳某猪场沼液样品质谱图

2.4 有机物对ANR颗粒污泥中主要脱氮功能菌群活性的影响

本研究进行了有机物对Anammox和AOM活性影响的试验，结果如图4和图5所示。结果表明，Anammox细菌的活性随有机物浓度(以COD计)的上升而上升，当COD浓度由0逐渐升至2160 mg·L-1时，Anammox细菌活性也随之由0.27 gN·g-1VSS·d-1升至0.38 gN·g-1VSS·d-1(升高约40%)；AOM活性却随着COD浓度的增加而逐渐降低，当添加540 mg·L-1COD时，AOM活性迅速由0.81 gN·g-1VSS·d-1下降至0.63 gN·g-1VSS·d-1，下降约22%；当添加2160 mg·L-1的COD时，AOM活性下降至0.52 gN·g-1VSS·d-1，下降约36%。可见，猪场废水厌氧消化液中，高浓度有机物可能会抑制AOM的活性，从而致使ANR脱氮效率的显著降低。

图4 有机物对ANR颗粒污泥中Anammox活性的影响

图5 有机物对ANR颗粒污泥中AOM活性的影响

许多研究者都开展了有机物浓度对Anammox细菌活性影响的研究。一些研究表明，高浓度的有机物会抑制Anammox细菌的活性。例如Tang[34]等人的研究表明，当添加800 mg·L-1COD的有机物后，比厌氧氨氧化活性则从0.27 gN·g-1VSS·d-1下降至0.07 gN·g-1VSS·d-1，下降了74.1%；Ni[9]等人的研究表明，当添加400 mg·L-1COD有机物后，厌氧氨氧化反应器的氨氮去除率从97.9%±0.8%下降至71%±0.7%；Zhu[35]等人的研究表明，当添加240 mg·L-1COD蛋白胨后，比厌氧氨氧化活性从0.45 gN·g-1VSS·d-1下降至0.23 gN·g-1VSS·d-1，下降约50%。而本研究的结果却表明，高浓度的有机物不仅不会抑制Anammox的活性，反而有助于Anammox细菌对氮素的脱除。反硝化细菌等其他菌群对底物亚硝酸盐和生态位的竞争，以及有机物代谢途径对氨和亚硝酸盐代谢途径的竞争是导致有机物影响Anammox活性的主要原因[21]。值得注意的是，本研究所采用的比厌氧氨氧化活性分析的是短期影响，无法分析有机物对Anammox活性的长期影响，因此，在未来的研究中，可通过反应器的运行进一步分析有机物对Anammox细菌的长期影响。

2.5 铜离子对ANR颗粒污泥中主要脱氮功能菌群活性的影响

本研究试验了不同铜离子浓度对Anammox和AOM活性的影响，结果如图6～图7所示。结果表明，当Cu2+浓度逐增加到2.5 mg·L-1时，Anammox活性由0.32 gN·g-1VSS·d-1逐渐降低到0.28 gN·g-1VSS·d-1，下降了30%；当Cu2+浓度逐渐增加到5 mg·L-1时，AOM活性由0.83 gN·g-1VSS·d-1略微上升至1.01 gN·g-1VSS·d-1，上升了21.7%；当Cu2+浓度继续由5 mg·L-1逐渐增加到50 mg·L-1时，AOM活性被明显抑制，下降至0.54 gN·g-1VSS·d-1，下降了46.5%。由以上分析可以发现，Cu2+对Anammox活性有明显的抑制作用，而Cu2+对AOM在低浓度条件下无抑制作用，只有当Cu2+浓度高达20 mg·L-1时才显示出明显的抑制。但是在前文20个不同猪场废水样品的检测中，我们发现Cu2+在猪场废水中的浓度为0～11.3 mg·L-1，均在20 mg·L-1以下水平，浓度较低，对AOM活性影响有限。此外，根据Zhang[36]等的研究认为，在细胞外Cu2+浓度过量的情况下，厌氧氨氧化细菌将主动运输Cu2+进入细胞内，使得细胞内Cu2+浓度升高。因为过量Cu2+对联氨脱氢酶(HDH)的抑制作用，使得HDH底物—联氨在细胞内累积。这不仅将造成细胞合成ATP所需的电子短缺，而且因为联氨的强还原性，细胞内损伤将会加剧。综上，猪场废水中，Cu2+是ANR颗粒污泥中主要脱氮微生物的抑制因子之一。

图6 铜离子对ANR颗粒污泥中Anammox活性的影响

图7 铜离子对ANR颗粒污泥中AOM活性的影响

2.6 戊二醛对ANR颗粒污泥活性和形态的影响

本研究还探究了戊二醛对ANR颗粒污泥中主要脱氮功能菌群活性和形态的影响。结果表明，戊二醛对ANR颗粒污泥中的AOM，Anammox和DB活性均有较大抑制作用，但由于ANR颗粒污泥中NOB活性极低，因此戊二醛对NOB活性影响趋势不明显(见图8～图11)。当戊二醛浓度为10 mg·L-1时，AOM，Anammox和DB活性分别下降了35%，11%和34%；当戊二醛浓度提升至50 mg·L-1时，AOM，Anammox和DB活性分别下降87%，71%和80%。戊二醛可使细胞外表面的蛋白质和脂质交联[37-39]，导致微生物细胞中的酶蛋白失活，从而使得ANR颗粒污泥主要功能微生物的生长代谢发生障碍，抑制微生物脱氮产能等过程。

图8 戊二醛处理对ANR颗粒污泥中AOM活性的影响

图9 戊二醛处理对ANR颗粒污泥中Anammox活性的影响

图10 戊二醛处理对ANR颗粒污泥中NOB活性的影响

图11 戊二醛处理对ANR颗粒污泥中DB活性的影响

本研究进一步探究了戊二醛对ANR颗粒污泥形态特性的影响，结果表明，戊二醛可使ANR颗粒污泥粒径逐渐变小，且戊二醛浓度越高，粒径越小(见图12)，当戊二醛浓度为10 mg·L-1时，可使ANR颗粒污泥的体积平均粒径(VMD)和表面积平均粒径(SMD)分别降低10%和30%；当戊二醛浓度为50 mg·L-1时，可使VMD和SMD分别降低31%和61%。同时，处理过程中，随着ANR颗粒污泥的解聚，培养液中的多糖含量也随戊二醛浓度增加而增加，当戊二醛浓度为50 mg·L-1时，培养液中的游离多糖含量由3.3 mg·L-1增加至11.4 mg·L-1，增加了3.5倍。众所周知，胞外多聚物(EPS)在ANR颗粒污泥的聚集中发挥着重要作用，EPS能够将细菌与其他细菌连接成一个聚集体，从而促进生物膜的形成[40]，而EPS主要由胞外蛋白和胞外多糖组成。总之，戊二醛不仅能够抑制ANR颗粒污泥的主要功能微生物活性，还可使ANR颗粒污泥中的多糖不断溶出至培养液中，从而导致颗粒的解聚和粒径的减小。

图12 不同浓度戊二醛处理ANR颗粒污泥48 h后粒径对比

3 结论

(2)有机物可显著抑制ANR颗粒污泥中主要功能菌群—好氧氨氧化菌(AOM)的活性。

(3)Cu2+对ANR颗粒污泥中AOM活性影响有限，对厌氧氨氧化细菌活性有明显的抑制影响。

图13 不同浓度戊二醛处理ANR颗粒污泥48 h后上清液多糖含量

(3)戊二醛对ANR颗粒污泥中AOM，Anammox，DB等脱氮微生物活性均有较强的抑制作用，且可使ANR颗粒污泥中起重要团聚作用的胞外多糖不断向环境中溶出，从而使得ANR颗粒污泥的稳定性降低，脱氮性能变差。