双氯芬酸联合顺铂通过热疗抑制肺腺癌A549细胞株的协同作用

田仁江，郑于臻，杨星萍，谭剑，申飘，蔡伟杰，廖洪映*

(1.广州医科大学附属肿瘤医院胸外科，广东 广州 510955；2.中山大学附属第六医院胸外科，广东 广州 510955)

肺癌是全世界最常见、最致命的恶性肿瘤之一。死亡人数约占癌症总死亡人数的1/5[1]。在中国，相比于其它肿瘤发病率，肺癌发病率在男性中排名第一，在女性中排名第二，仅次于乳腺癌[2]。恶性胸腔积液(MPE)是癌症的常见并发症之一，据估计，仅仅在美国每年至少有15万例癌症患者出现胸腔积液症状[3]，引起MPE的最常见原因是肺癌和乳腺癌[4]，且出现MPE的肺癌和乳腺癌患者总数占所有癌症患者合并MPE的一半以上[5]。非小细胞肺癌患者合并MPE的组织类型主要为腺癌[6]。根据国际肺癌肿瘤研究协会最新的TNM分期系统，肺癌合并胸腔积液归类为M1a期疾病[7]，预后差，其中位生存期为3～12个月[8]，甚至有癌症中心观察到中位生存期为5个月[9]。

胸腔热灌注是指用物理方法将生理盐水升温至高于37 ℃的某个温度后，将生理盐水注入胸腔，使腔内保持一定的温度并持续一段时间，最终杀灭胸腔内残余的肿瘤细胞。双氯酚酸是一种非甾体抗炎药(NSAID)，有解热、镇痛的疗效。同时也是一种葡萄糖转运体抑制剂，能够影响肿瘤细胞代谢[10]，近年也有研究报道其可以用来治疗癌症[11-12]。本研究以人肺腺癌A549细胞作为研究对象，通过体外模拟胸腔热灌注的方法(不同温度下细胞培养)比较双氯酚酸和顺铂在不同温度下对A549细胞生长的影响，并观察双氯酚酸在43 ℃下能否增强顺铂对A549细胞的热化疗作用。旨在为肺癌合并MPE患者探索潜在的、新的有效治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验细胞人肺腺癌A549细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.1.2主要试剂Ham’s F-12k培养基来源于武汉普诺赛生命科技有限公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，顺铂由中国齐鲁制药有限公司生产，双氯酚酸购自山东京卫制药有限公司。MTS试剂来自上海普洛麦格生物制品有限公司，凋亡检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司公司，兔抗Bax BCL-2一抗购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 向含有人肺腺癌A549细胞株的培养瓶中加入10%胎牛血清的Ham’s F-12K培养基，放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养，取处于对数生长期的细胞进行后续实验。

1.2.2MTS法测实验浓度 取对数生长期细胞，胰酶消化成单细胞悬液，混匀进行细胞计数后，往96孔板A板和B板每孔加入100 μL 5×104/mL浓度的单细胞悬液，向96孔板C板和D板每孔加入100 μL 8×104/mL浓度单细胞悬液，待细胞贴壁后,弃去旧培养基，A板和B板分别加入200 μL含有不同顺铂浓度(0、1、2、4、8和16 μg/mL)的培养基,C板和D板分别加入200 μL含有不同双氯酚酸浓度(0、0.025、0.05、0.1、 0.2和0.4 μmol/L)的培养基，每个浓度设置4个复孔，另设一组只添加培养液而没有细胞的孔为空白对照组，用于调零。A板和C板先放入43 ℃ 5%CO2培养箱中培养1 h后，再放回37 ℃培养箱中继续培养23 h；B板和D板直接放入37 ℃培养箱培养24 h;向ABCD板中每实验孔加入20 μL 5 mg/mL MTS试剂，再放回37 ℃培养箱中孵育2～4 h,用多功能酶标仪读取出各板在波长490 nm时的吸光度值，计算细胞增殖抑率，重复上述实验3次，应用Probit 回归分析得出两药物的IC50(半数致死率)并确定两药物的实验浓度。

1.2.3实验分组及处理 空白对照组：加2 mL不加任何药物的培养基培养；顺铂组：加入2 mL含有顺铂实验浓度的培养基培养；双氯酚酸+顺铂组：加入2 mL含有双氯酚酸和顺铂实验浓度的培养基培养；三组细胞先放入43 ℃、5% CO2培养箱中培养1 h，再放回37 ℃、5%CO2培养箱中培养23 h。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡率 按上述实验分组及处理后，收集旧培育基和胰酶消化的细胞悬液，5×103rpm离心5 min，用PBS缓冲液洗涤2次，500 μL 1 X Binding Buffer重悬，每组细胞分别加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI,轻柔混匀，室温避光孵育5 min后进行流式分析，重复上述实验3次，计算各组细胞总凋亡率，取3次细胞总凋亡率平均值。

1.2.5RT-PCR检测RNA的表达 按上述实验分组及处理后，先将所需实验物品进行去 Rnase 处理，按Trizol法提取出总RNA后，应用超微量分光光度计仪器测出各组RNA浓度；冰上配制逆转录反应体系，设置逆转录反应条件，得到cDNA,然后在冰上按试剂说明书配置RT-PCR扩增反应体系，在实时荧光定量PCR仪上设置扩增反应程序后进行扩增，得到扩增曲线和溶解曲线，重复上述实验3次，分析数据，作图。

1.2.6蛋白免疫印迹法检测蛋白表达 按上述实验分组及处理后，分别加入适量细胞裂解液，冰上裂解30 min,收取裂解液，超声，离心，吸取上清液蛋白；应用BCA法测出各组蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液，加热变性，计算各组上样体积，配12%下层胶和5%的浓缩胶，组装电泳装置进行上样、电泳；用甲醇预先活化PVDF膜，组装转膜装置进行转膜，将含目的蛋白条带的PVDF膜放入5%脱脂奶粉封闭液中室温封闭2 h,剪膜，放入一抗(稀释比例1∶1 000)孵育过夜；用TBST液洗膜3次，放入二抗(稀释比例1∶8 000)室温孵育2 h,TBST液洗膜3次，配置发光液，应用全自动发光图像分析仪进行发光，通过图像处理软件进行结果分析。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 双氯酚酸和顺铂实验浓度的测定

不同浓度的双氯酚酸和顺铂对A549细胞的增殖均有抑制作用，且随着药物浓度的增加，抑制效应越强。在同一浓度下，顺铂43 ℃热疗时对A549细胞的抑制作用均大于37 ℃热疗。差异有统计学意义(P<0.05)，而双氯酚酸43 ℃热疗时的抑制作用与37 ℃热疗时无明显差异(图1)；应用Probit回归分析得出结果：双氯酚酸在37 ℃与43 ℃时得IC50分别是0.138 μmol/L、0.144 μmol/L；顺铂在37 ℃与43 ℃时的IC50分别是4.702 μg/mL、3.234 μg/mL。因此本研究分别选取接近IC50的药物浓度(双氯酚酸：0.15 μmol/L顺铂：4 μg/mL)来作为后续实验浓度。

90807060504030201009080706050403020100增殖抑制率(%)AB37℃45℃37℃45℃0.00.10.20.30.40.5024681012141618药物浓度(μmol/L)药物浓度(μg/mL)增殖抑制率(%)

2.2 双氯酚酸能增强热化疗对A549细胞的凋亡作用

流式细胞仪检测A549细胞凋亡率结果显示，对照组、顺铂组和双氯酚酸+顺铂组的平均细胞总凋亡率分别为(12.53±0.51)%、(24.82±3.93)%、(56.07±1.97)%(图2)。顺铂组的平均细胞总凋亡率和双氯酚酸+顺铂组平均细胞总凋亡率之间的差异有统计学意义(P<0.01)(图3)，结果说明双氯酚酸可增强顺铂热化疗对A549细胞的凋亡。

对照组顺铂组双氯酚酸+顺铂组

*806040200细胞总凋亡率(%)对照组顺铂组双氯酚酸+顺铂组

2.3 双氯酚酸能影响顺铂对凋亡相关基因Bax/Bcl-2 mRNA的表达

以对照组2-ΔΔCt值为参照(设定为1)，顺铂组和双氯酚酸+顺铂组Bax mRNA平均相对表达量分别为2.58±0.22、1.61±0.09；Bcl-2 mRNA平均相对表达量分别为0.28±0.04、0.04±0.02。与对照组相比，顺铂组和双氯酚酸+顺铂组的促凋亡基因Bax mRNA表达量均上调，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达量均下调；与顺铂组相比，双氯酚酸+顺铂组Bax mRNA表达量、Bcl-2 mRNA表达量低，差异均具有统计学意义(P<0.05)(图4A);图3B为各组Bcl-2/Bax比值大小情况，与顺铂组相比，双氯酚酸+顺铂组bcl-2/Bax比值明显降低，两者之间的差异具有统计学意义(P<0.01)。证明双氯酚酸总体促进了顺铂热化疗对A549细胞的凋亡作用。

***3210210.20.10.0BaxBcl-2对照组顺铂组双氯酚酸+顺铂组对照组顺铂组双氯酚酸+顺铂组

2.4 双氯酚酸能影响顺铂对凋亡相关基因Bax、Bcl-2 蛋白的表达

与对照组相比，顺铂组和双氯酚酸+顺铂组促凋亡基因Bax 蛋白表达均上调，且双氯酚酸+顺铂组上调更明显；抗凋亡基因Bcl-2 蛋白均下调，且双氯酚酸+顺铂组下调更明显(图5)。

BaxBcl-2β-actinβ-actin对照组顺铂组双氯酚酸+顺铂组

3 讨 论

恶性胸腔积液是非小细胞肺癌的常见并发症之一。在非小细胞肺癌患者中，肺癌合并胸腔积液患者约占15%[13]。胸腔积液是肺癌的一个独立危险因素，当肺癌患者出现恶性胸腔积液症状时，往往意味着晚期肺癌，预后差,主要是用化疗、胸水穿刺引流、胸膜固定术等进行姑息治疗[14]。胸腔热化疗是临床上可供患者选择的一种安全、有效的治疗方法，有研究报道，56例肺癌合并胸腔积液患者经VATS(电视胸腔镜)下胸腔热化疗后胸腔积液得到完全缓解，且中位生存期延长至21.7个月[15]。双氯酚酸在临床上常常作为非甾体抗炎药来发挥解热、阵痛的效应。近年来研究发现双氯酚酸具有潜在的抗肿瘤效应[11-12]。本研究用体外模拟胸腔热化疗联合或不联合双氯酚酸的方法，观察双氯酚酸能否促进顺铂在43 ℃下对A549细胞凋亡的影响。

本研究MTS实验结果表明，双氯酚酸和顺铂对A549细胞均有增殖抑制作用，且随着药物浓度的增加，抑制率越大。Smirnova等[16]的研究也证实了双氯酚酸对A549细胞的抑制作用呈浓度依赖形式；而关于双氯酚酸与温度在抑制肿瘤细胞增殖方面是否具有协同作用，目前国内外未见有相关文献报道，本研究结果显示，在同一药物浓度下，双氯酚酸43 ℃条件下对A549细胞的抑制率相较于37 ℃条件下抑制率无明显差异(P>0.05)，表明温度与双氯酚酸对A549细胞的抑制无协同作用；而顺铂在43 ℃条件下的抑制率比37 ℃热疗抑制率高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明43 ℃温度下能增强顺铂对A549细胞的抑制作用。Sukovas等[17]的研究也说明温度可以增强顺铂的细胞毒性作用。为提高顺铂等传统金属药物的抗肿瘤效应，Intini等[18]研究了双氯酚酸-铂结合物对肿瘤细胞的作用机理，实验结果显示双氯芬酸-铂结合物对人卵巢癌细胞的抑制作用比顺铂更强的同时，发现双氯酚酸可以减少人卵巢癌细胞和人结肠癌细胞对顺铂的耐药性，并通过改变线粒体膜电位、抑制侵袭和迁移等和顺铂发挥双重抗肿瘤增殖的作用。Johnsen等[19]的研究结果也表明双氯酚酸能改变神经母细胞瘤细胞的线粒体膜电位，激活procaspase-9和procas-pase-3，最终诱导神经母细胞瘤细胞凋亡。本研究实验结果显示，与顺铂组细胞总凋亡率相比，双氯酚酸联合顺铂组细胞总凋亡率明显高于顺铂组，提示双氯酚酸能促进顺铂热化疗对A549细胞的凋亡作用。并且这种促进作用可能是通过线粒体相关途径实现的。Bcl-2与Bax分别是常见的抗凋亡和促凋亡基因，Bcl-2低表达或Bax高表达可促进细胞凋亡[20]。Bcl-2/Bax比值大小对细胞凋亡起决定性作用[21]。Bcl-2/Bax比值高提示细胞处于抗凋亡状态，Bcl-2/Bax比值低说明细胞处于促凋亡状态。本研究RT-PCR结果显示，与对照组相比，顺铂组与双氯酚酸+顺铂组的Bax mRNA表达均上调，且顺铂组上调更明显，顺铂组与双氯酚酸+顺铂组Bcl-2mRNA表达均下调，且双氯酚酸+顺铂组下调更明显。双氯酚酸+顺铂组的Bax mRNA表达量比顺铂组低考虑与双氯酚酸的负性作用有关，但就Bcl-2/Bax比值来说，顺铂+双氯酚酸组Bcl-2/Bax比值较顺铂组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；蛋白印迹实验结果显示，与顺铂组相比，双氯酚酸+顺铂组的促凋亡Bax蛋白表达上调，抗凋亡Bcl-2蛋白表达下调。与预期实验结果一致。证明双氯酚酸能促进顺铂热化疗对A549细胞的凋亡。值得注意的是，双氯酚酸+顺铂组Bax mRNA表达低于顺铂组，但Bax蛋白表达水平高于顺铂组，可能是样本量不足，下一步需提高样本量来进一步验证。

综上所述，体外双氯芬酸和顺铂均能抑制A549细胞增殖，热疗联合顺铂对A549细胞的抑制有协同作用，而与双氯酚酸则无。双氯酚酸联合热化疗对A549细胞的促凋亡效应优于单纯热化疗。