乳制品细菌总数霉菌酵母快速检验方法的研究

夏元凤 刘旭 潘玉爱 周宇晨

大连产品质量检验检测研究院有限公司 辽宁大连 116033

乳制品细菌总数的把控，是食品卫生安全管理的重点内容，选择科学合理的检验方法十分重要。目前我国的乳制品细菌总数检验中，多是选择平板培养方法实现，耗时大概在40h以上，检测耗时长、成本高。面对不断增长的检验要求，传统的检验方法局限性愈加明显，无法满足实际工作需求，迫切的需要整合乳制品检测资源，积极推动检测方法创新优化，力求在提升检测效率和质量同时，尽可能降低检测成本。

1 乳制品细菌总数快速检验方法

流式细胞法：流式细胞法（Flow Cyto metry，FCM）是一项能够对高压驱动的样品流中单个受激光照射的细胞进行快速检测的技术，可以用于细菌、霉菌毒素和病毒等微生物的快速检测，在肿瘤学、微生物学、免疫学、血液学和环保、水处理及农业生产中都有重要的应用。流式细胞法进行细胞检测具有综合性、速度快和参数多的特点，该方法集合了激光、计算机和图像等多项技术以及流体力学、单克隆抗体技术、细胞化学等多个领域的知识和成果，可以在1s内对数万个细胞的理化特性等多个参数进行检测。例如，Laplace-Builhe等使用FCM快速检测酸奶和奶酪中的乳球菌；Malaerino等使用FCM检测啤酒里存活细菌数量，并取得了和标准平板菌落计数一致的结果；FCM还可以同时检测活菌和死亡细菌的数量。

伏安法是电势控制法一种，这类方法电极电势强制依附于已知程序，电势控制在恒定值或按预先确定方式随时间变化，测量电流作为时间或电势函数。伏安法测定食品中的细菌只需半小时左右，为食品的卫生防疫和监督管理提供一种快速有效方法。在无菌箱内，准确吸取一定量的待测乳制品，加入预先置入细菌滤膜的微型油滤器中。开启真空泵，迅速抽滤制成细菌阻留膜，把此膜附着在无菌罩中的玻碳电极上，插入以不同缓冲溶液为底液的反应池中，控制电解池内温度为25℃，选择不同的参比电极，以铂电极作为辅助电极，以不同的时间进行伏安测定，以100mV/s的扫速，在0～1.5V范围扫描，记录伏安扫描曲线。所得峰电流值与相应样品的校正工作曲线对照，计算样品的细菌总数。

2 乳制品霉菌快速检验方法

霉菌和酵母菌同属真菌类，具有相似的生理生化特征和细胞壁结构，因此乳制品中霉菌的检测方法与酵母菌的检测方法类似。由表1可以看出，霉菌菌丝和孢子的直径均在3μm以上，大于牛奶中各组分的尺寸，因此可以用孔径为3μm的微孔滤膜过滤酸奶，以实现对酸奶中霉菌的富集。霉菌属于真菌类，细胞壁分为三层，外层是无定型的β葡聚糖，中层是糖蛋白，内层是几丁质纤维，与酵母菌的细胞壁结构相似，试验发现2μL的酵母菌浓缩液用3μL0.02%浓度的次甲基蓝染液染色即可达到较好的效果，始于微生物快速检测系统的处理和计数。

表1 牛奶中各组分的尺寸

在无菌操作环境下，取1mL酸奶于小试管中，加入9mL生理盐水稀释10倍，制成待检样品。用无菌针管吸取5mL待检样品，通过孔径为3μm的微孔滤膜过滤，然后再打入50μL无菌空气，用针管反复吹吸几次使浓缩菌液混匀。用微量移液器取出滤膜上方2μL液体滴在玻片相应的位置上，自然晾干后在菌膜处滴加3μL浓度为0.02%的次甲基蓝染液，染色1min，用滴管吸取蒸馏水轻轻冲掉染液，晾干后插入微生物快速检测系统检测。

3 乳制品酵母快速检验方法

酵母菌在厌氧条件下发酵产生乙醇，在酸性条件下乙醇能被橙红色的重铬酸根离子氧化，而重铬酸根离子还原成灰绿色的三价铬离子。反应方程式如下：

产生的Cr3+在波长为594nm光下有最大吸收峰，吸光度值与Cr3+浓度呈线性关系。由表1可知，除脂肪球以外酵母菌的尺寸跟跟牛奶中的其他组分没有重复区域，因此可以利用1.2μm的滤膜过滤达到酵母菌富集的目的。

在超净工作台中，用量筒量取50mL无菌生理盐水于锥形瓶中，加入安琪酵母0.5g，晃动充分混匀后用棉塞封口，在恒温培养箱中35℃活化30min。①酵母菌染色条件的确定。在无菌环境下用移液枪吸取上述活化酵母菌菌液2μL，在模板比对下滴于载玻片的中央位置，倒置载玻片室温下自然晾干。将载玻片背面在酒精灯火焰上放迅速通过2-3次，以感觉不烫手为宜，此时酵母菌菌体紧贴在载玻片上。然后取3μL染液滴在载玻片上覆盖菌膜，一段时间后用无菌水缓慢冲洗，晾干后用微生物快速检测仪观察。②验证方法的可行性。在无菌操作环境下，取1mL酸奶于试管中，用生理盐水稀释10倍。取1mL活化的酵母菌液加入到9mL稀释后的酸奶中，搅拌混匀后用无菌水稀释10倍制成待检样品。用注射器吸取样品5mL，在孔径为1.2μm的微孔滤膜上过滤，然后再向滤膜中打入50μL无菌空气，此时微孔滤膜的上层截流液剩下20μL，反复吹吸使浓缩菌液混匀，截流液即为含有酵母菌的浓缩液，过滤后用微量移液枪从过滤器中吸取2μL截流液，滴于载玻片上染色制片镜检。同时，吸取2μL截流液于无菌培养皿上，用1mL生理盐水稀释后，倾倒孟加拉红培养基制作平板，做3个平行，在恒温培养箱中25℃培养48h，观察计数。吸取滤液1mL于无菌培养皿上，用孟加拉红培养基倾倒平板，做3个平行，恒温培养箱中25℃培养48h，观察计数。

4 结语

总而言之，20世纪60年代开始，许多发达国家已经开始进行微生物快速检测技术的研究，快速检测的试剂、试剂盒和仪器广泛使用，但是检测费用昂贵。建立一种测定准确、运行成本低、操作简便的快速检测方法对于乳品行业来说具有巨大的经济价值。这就要求我们在以后的实际工作中必须对其实现进一步研究探讨。