30种观叶秋海棠花粉活力检验方法筛选及活力测定

杜文文，段 青，杨 楠，蔡晶晶，林培胜，马璐琳，王祥宁，贾文杰，崔光芬*

(1.云南省农业科学院花卉研究所/国家观赏园艺工程技术研究中心，云南 昆明 650205；2.云南农业大学园林园艺学院，云南 昆明 650201；3.大姚县六苴镇农业农村服务中心 ，云南 大姚 675400)

【研究意义】秋海棠属于秋海棠科秋海棠属，多年生草本植物，约1900种、15000多个园艺品种[1-2]。依据观赏性，可分为观花、观叶和花叶兼赏3类[3]，其中观叶类叶形、叶色变化丰富，有很多种类具有多彩的叶斑，深受人们喜爱，是极佳的花镜材料，具有市场前景。培育新的观叶秋海棠品种，不仅可以满足市场需求，还能创造新的种质，丰富该物种的多样性。杂交育种是新品种选育的重要手段，较高的花粉活力是确保授粉受精正常进行的前提条件[4]，因此，测定秋海棠花粉活力能为优良授粉品种选配提供重要依据，有效提高杂交结实率，对杂交育种成功与否具有实际指导意义。【前人研究进展】花粉活力最常用的测定方法有染色法[5-7]和花粉离体培养法[8-10]。染色法操作简便，能快速测定花粉活力，但受花粉自身特性影响大，稳定性差，离体培养法虽能较真实反应花粉活力，但在无资料可参考的情况下，需进行一系列预备实验，以确定最适培养基和培养条件，操作复杂[11-13]。因此，不同种类应选择合适的方法检测其花粉活力。目前有关秋海棠花粉活力的报道较少，且主要为野生种类，陈雄伟等[14]采用I2-KI染色法测定了紫背天葵(B.fimbristipulaHance)花粉活力，花开后3 d活力最强。通过离体培养，赵宝林等[15]观察到中华秋海棠[B.grandisDry subsp. (A. DC.) Irmsch]从开放几小时到即将萎蔫的雄花花粉均有活力。彭镜毅等[16]运用孢粉染色法检测出台北秋海棠(Begonia×taipeiensis)花粉败育率极高。Dewitte 等[17]用Fluorescein diacetate (FDA)染色法观测南美洲秋海棠7个杂交组合后代的花粉活力，平均活力只有3.5%，73%的杂交后代败育。【本研究切入点】观叶秋海棠种类较多，而针对更多的野生种和市场上流行的商业品种的花粉活力研究较少。【拟解决的关键问题】以30种观叶秋海棠为试材，采用不同方法测定其花粉活力，寻找测定秋海棠花粉活力的有效方法，比较不同种类之间花粉活力大小的差异，为观叶秋海棠杂交育种提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

30种观叶秋海棠，种植于云南省农业科学院花卉研究所秋海棠育种基地，包括15个野生种和15个商业品种，均具一定观赏性。

1.2 试验方法

各种类秋海棠的花期集中在9-10月，中午采集盛花期雄花带回实验室，采用不同方法测定花粉活力，同时采集了火焰开放1～8 d的雄花和雌花，观察火焰不同开放天数雄花花粉的活力和雌花柱头的可授性。

1.2.1 TTC染色法 称TTC 0.5 g或1 g溶解于100 mL 磷酸盐缓冲溶液中，配好的溶液倒入棕色试剂瓶内，4 ℃保存待用。检测时选取5个种类，先进行预实验，取2～3滴TTC染液于载玻片上，用毛笔将它们的新鲜花粉分别轻弹到各自载玻片溶液中，35 ℃恒温箱染色30 min 左右，镜检，红色花粉粒有活力，淡红色或无色花粉粒活力低或无活力[6]。重复6次，每个玻片取6个视野进行统计，每个视野中的花粉粒数不少于30 粒。若5个种类均可染色，则其他种类也采用此方法。

花粉活力(%)=红色花粉数量/观测花粉总数 × 100

1.2.2 I2-KI 染色法 配置2% I2-KI 溶液，置于棕色试剂瓶中4 ℃保存待用。方法与TTC法类似，先进行预实验，染色10 min后在显微镜下观察，有活力的花粉呈蓝色，活力衰弱或内含物少的花粉呈黄褐色[6]。若预实验成功，则用该方法检测所有种类花粉。

花粉活力(%)= 蓝色花粉数量/观测花粉总数 × 100。

1.2.3 孢粉染色法 参照陈家瑞[18]的孢粉染色法。称取95%乙醇10 mL，孔雀绿10 mg，蒸馏水50 mL，丙三醇25 mL，酚5 g，水合氯醛5 g，酸性品红50 mg，桔红G 5 mg，冰醋酸1～4 mL，配制孢粉染液，其中冰醋酸量的加入依孢粉壁的厚度而定，薄的用1～2 mL，厚的用3～4 mL。配好的试剂倒入棕色瓶内，暗处保存。检测方法同上述方法，室温染色30～40 min后显微镜下观察。有活力的花粉原生质红色，无活力的花粉细胞壁被染成绿色。

花粉活力(%)=红色花粉粒数/观测花粉粒总数 × 100

1.2.4 离体培养法 离体培养基为10% 蔗糖 + 0.01% H3BO3+ 0.01% CaCl2+ 0.02% MgSO4·7H2O+0.01% KH2PO4的固体培养基或液体培养基。将培养基倒入培养皿中，花粉均匀撒在培养皿上，25 ℃光照或黑暗培养3～4 h，花粉管萌发长度超过1/2 花粉直径，则视为具有活力。3 次重复，每个重复观察6个视野，求平均值作为花粉萌发率，同样选取5个种类进行预实验。

花粉萌发率(%)= 萌发花粉粒数/观测花粉粒总数 × 100

1.2.5 柱头可授性 采用联苯胺-过氧化氢法测定[19]，将火焰不同开放天数雌花的柱头，置于联苯胺-过氧化氢溶液中，反应液配方为1%联苯胺∶3%过氧化氢∶水=4∶11∶22(体积比)。若柱头具有可授性，其周围呈现蓝色并有大量气泡产生。

1.2.6 数据处理 采用SAS软件对不同种类的花粉活力进行单因素方差分析，使用R软件绘制30种秋海棠花粉活力大小、聚类图与火焰不同开放天数花粉活力变化。

2 结果与分析

2.1 4种花粉活力测定方法比较与分析

银点秋海棠(B.deliciosaLinden ex Fotsch)、火焰、晚秋红、冰川和蕾丝洛森的花粉经TTC 溶液或I2-KI溶液染色后，花粉颜色均未有明显变化，染色时间延长，效果仍不理想；花粉经过夜离体培养后未观察到萌发；孢粉染色法中所有种类花粉均可被染色，且能很好的区分有活力花粉和败育花粉(图1)，这一结果表明TTC和I2-KI染色法可能不是检测秋海棠植物花粉最有效的方法，实验所用的离体培养基不适合秋海棠植物花粉活力检测，相比较其他3种方法，孢粉染色法可用于秋海棠植物花粉活力的快速测定。

2.2 不同种类花粉活力大小比较与分析

由于TTC染色、I2-KI 染色和花粉离体萌发培养3种方法均未获得有效数据，实验结果只针对孢粉染色法测定的数据进行分析。所有种类花粉均可被染色，且能很好的区分有活力花粉和败育花粉(图1-c)。测定的30种秋海棠花粉均有活力，花粉活力范围为34.83%～98.58%，花粉活力橙花秋海棠(B.croceaC.I Peng)最高(98.58%)，火焰最低(34.83%)，极差为63.75%；不同种类之间花粉活力差异大，15个野生种中，除中华秋海棠(B.grandis)(76.66%)、坪林秋海棠(B.pinglinensisC. I Peng)(79.59%)、棱角秋海棠(B.angularisRaddi)(82.61%)和歪叶秋海棠(B.augustineiHemsl)(84.32%)4个种类花粉活力低于85%外，其余11个的均高于90%，野生种的平均花粉活力为91.39%。15个商业品种中，红宝石鞋花粉活力高，为90.81%，蕾丝洛森、北极风、火烧云和晚秋红花粉活力在80%～90%，分别为87.32%、86.95%、86.02%和83.42%；花粉活力在 70%～80%有4个，为星光(79.24%)、粉丝带(77.90%)、烟霞(75.73%)和萨尔萨(75.61%)，而非洲丛林(68.11%)、红色探戈(65.04%)和埃特纳(61.67%)3个品种的花粉活力则在60%～70%，冰川花粉活力稍低于60%，为58.61%，小可爱(43.88%)和火焰(34.83%)花粉活力均低于50%，商业品种的平均花粉活力为71.67%(表1，图2)，说明测定的30种观叶秋海棠中，野生种的平均花粉活力较商业品种高。一般杂交选配时，除观赏性、抗逆性、授粉亲和性、花粉活力外，花粉量也是选择父本的重要因素[20]，采集花粉时发现，所测的28个花粉活力较高的种类，其花粉量也较多，花粉活力低的小可爱和火焰花粉量则偏少，因此，杂交时橙花秋海棠、红宝石鞋等28个种类可以做父本，小可爱和火焰则做母本更好。

表1 30种秋海棠花粉活力

除柳叶秋海棠(B.fuchsioidesHook.)和长翅秋海棠(B.longialataK. Y. Guan & D. K. Tian)、彩纹秋海棠(B.masonianavar.maculataS. K. Chen, R. X. Zheng & D.Y. Xia)和光滑秋海棠(B.psilophyllaIrmsch.)、蕾丝洛森和北极风、粉丝带和中华秋海棠、烟霞和萨尔萨、非洲丛林和红色探戈、埃特纳和冰川花粉活力标注的字母一样外(P>0.05)，其他种类花粉活力两两比较，标注字母均不同，有的种类间还存在显著差异(P<0.05)；火焰和小可爱相比，花粉活力差异显著，且二者显著低于其他28种秋海棠(P<0.05，表1)。采用最短距离法对30种秋海棠进行聚类，在遗传距离0.2处，可将30种秋海棠分为6个类群，第Ⅰ类群包含12个种类，花粉活力均在90%以上，第Ⅱ类群也包含12个种类，花粉活力在75%～90%，第Ⅲ类群包含两个种类，为非洲丛林和红色探戈，花粉活力在70%左右，第Ⅳ类群也包含两个种类，为埃特纳和冰川，花粉活力在60%左右，第Ⅴ类群和第Ⅵ类群都只包含一个种类，分别为小可爱和火焰，花粉活力均低于50%(图3)，说明秋海棠花粉活力多样性丰富。

2.3 火焰花朵开放不同天数花粉活力和柱头可授性分析

火焰花粉量少，花朵开放1 d的雄花散粉极少，数据不易采集，开放8 d花朵萎蔫，常脱落，故只观测了花朵开放2～7 d的花粉活力，也说明火焰单花周期为7 d左右。开花后2、3、4、5、6、7 d，花粉活力均较低，分别为32.48% 、32.51%、33.28%、42.15%、36.82%、36.47%，花粉活力大小变化趋势为先增大后减小，花开后5 d花粉活力最强(42.15%,图4)。柱头可授性表明，火焰雌花自开放到凋落，其柱头均有可授性，因此，该种类杂交时更适合做母本。采集雄花时发现花药散粉量会随开放天数增加而增多(图5)，杂交育种中有采用火焰花粉进行授粉获得杂交种子的情况，因此，若以火焰为父本进行杂交，宜采用开放5 d的雄花进行授粉。

火焰叶片肉质，卵形，整个叶片为红色，有金属光泽，符合中国人的审美，具有较好的市场前景，但株形松散、不紧凑，降低了观赏性，且不利于包装和运输，为获得更多的杂交种子，培育更好的红色观叶秋海棠品种，可以用火焰为母本，与株型紧凑的父本品种进行杂交，或者以株型紧凑的品种为母本，采用开放5 d左右的火焰花粉进行授粉，选育叶色、株型更优良的后代。

3 讨 论

3.1 秋海棠花粉活力测定方法

研究中采用4种方法检测秋海棠花粉活力，结果TTC和I2-KI 染色效果不理想，离体培养基上未见花粉萌发，只有孢粉染色法可以很好地区分有活力花粉和无活力花粉，前人采用I2-KI染色和离体培养法分别检测紫背天葵和中华秋海棠的花粉活力[14-15]，与预实验结果有不同，这可能是所选择的秋海棠种类不同或溶液或培养基配方有差异所致；彭镜毅等[16]使用孢粉染色能有效观察台北秋海棠花粉活力，也有相同实验结果。

测定的30种观叶秋海棠，不同种类之间花粉活力存在差异，野生种中有11个花粉活力在90%以上，其余4个的也高于75%；商业品种中花粉活力较高的有红宝石鞋(90.51%)、蕾丝洛森(87.42%)、晚秋红(83.42%)和星光(79.24%)等，而火焰和小可爱花粉活力则偏低，实际杂交过程中也发现测定的部分野生种如光滑秋海棠、掌叶秋海棠、银点秋海棠等和部分商业品种如蕾丝洛森、北极风、晚秋红、星光等自交和杂交结实率均较高，而 火焰与其他种类杂交时，杂交结实率低、小可爱做父本几乎不能获得杂交种子，说明孢粉染色法所得数据可靠，可以作为测定秋海棠植物花粉活力的一种快速有效测定方法。

3.2 秋海棠多样性与可育性

秋海棠多样性极其丰富，种类、生态、生境、形态特征、染色体、基因组大小等方面均表现出多样性[21-23]。通过最短距离法可以将30种秋海棠分为6个类群，花粉活力大小分别为90%以上、75%～90%、70%左右、60%左右、45%左右和35%左右，说明秋海棠花粉活力也存在多样性，进一步丰富了对秋海棠属植物多样性的认识。

花粉活力能够作为反映雄配子发育状况的一项指标，对花粉活力进行分级，可以将不同品种划分为不同等级的育性，并为后续杂交亲本选配提供依据。一般花粉可育率为0，定为全不育；小于5%，为高不育；6%～30%，为半不育；31%～50%，为低不育；大于50%，为正常可育[24]。参照这种等级法，可将30种观叶秋海棠划分为正常可育和低不育两类，其中正常可育含有28个种类，杂交时可以做父本，低不育有2个种类，适宜做母本。

3.3 花粉活力变化

检测到火焰不同开放天数花朵的花粉活力随开放天数的增加先增大后减小，开放后5 d活力最高。紫背天葵花朵的花粉活力也是随开放天数的增加呈先增加后下降的趋势，开花后3 d 花粉活力达到最高(76.0%)[14]。杨小丹等[25]在研究不同品种兰花花粉活力时，发现国兰花粉活力在花朵开放0 ～20 d处于增长期，之后花粉活力随花朵开放时间的增加而降低。因此，杂交时应先确定植物花粉活力最高的时期，并选择该时期进行杂交授粉，这样有助于提高杂交结实率。

4 结 论

孢粉染色法可以快速有效的测定秋海棠植物花粉活力，秋海棠花粉活力多样性丰富，本实验的30种观叶秋海棠有28个种类正常可育，可作父本进行杂交，小可爱和火焰为低不育，杂交时更适合做母本，火焰若做父本，应采集开放5 d的花粉，该项研究对提高杂交效率具有实际指导意义。