饲喂胡萝卜对昆明小鼠免疫功能的影响*

刘 慧，赵明星，王玉辉，沈 今，陈增汀，许 多，秦延苓，徐德立

(曲阜师范大学生命科学学院，273165，山东省曲阜市)

0 引 言

免疫反应一般是指生物体内的免疫系统识别并通过免疫应答清除自身病变肿瘤和侵入生物体“异我”的过程[1].动物的免疫系统能够抵御环境中的病原体例如病毒、细菌和真菌等的入侵，对于保障动物的生存具有重要作用.免疫功能是否正常对于动物体的健康生存至关重要，它在一定程度上可以反映动物的生存能力并影响到动物的适合度[2].影响动物免疫能力的因素有很多，如季节、温度、光周期和食物等[3-5].其中食物质量是影响动物免疫功能重要的影响因素之一，食物的影响包括食物数量和食物成分的变化对免疫的作用.

胡萝卜为伞形科植物，花极小，含有丰富的营养物质，有脂肪、蛋白质和各类维生素等，其中含量最高的是深橘色的胡萝卜素[6].根据功能组分，类胡萝卜素分为叶黄素类和胡萝卜素类.研究表明，类胡萝卜素不仅在动物生产性能和繁殖功能发挥重要作用，还可提高机体免疫能力[7-8].补充类胡萝卜素可增加虹鳟(Oncorhynchusmykiss)血清补体、溶菌酶活性和免疫球蛋白含量[9].胡萝卜素主要有α、β和γ共3种形式，其中β-胡萝卜素含量最多且活性最强[10].在肉牛(Goveрastoka)的饲粮中添加不同水平的β-胡萝卜素，通过对血液生理指标的检测，发现β-胡萝卜素提高了血液中中性粒细胞(neutrophil,GRNA)和淋巴细胞百分比(lymphocyte,LYM)[11].补充β-胡萝卜素可以被猪(Svinja)的淋巴细胞特异性吸收进而增强其免疫功能[12]；同样补充β-胡萝卜素可以增加小鼠体内IL-2、IL-4以及抗体水平含量[13].补充β-胡萝卜素也可促进辐射小鼠T-淋巴细胞增殖，增强自然杀伤细胞的杀伤活性以及IL-2活性，提高小鼠细胞免疫水平[14].然而，饲喂胡萝卜是否会对动物免疫功能产生影响尚未可知，有必要研究胡萝卜对不同物种免疫功能的影响.

细胞免疫属于获得性免疫系统，植物血球凝集素(Phytohaemagglutinin,PHA)反应用于反映哺乳动物细胞免疫能力[15].免疫器官如胸腺和脾脏也可以反映免疫功能.白细胞参与免疫反应，因此白细胞数目也能反映动物的健康水平[16].

本实验以成年雄性昆明小鼠为研究对象，探究饲喂胡萝卜对其免疫能力的影响，我们预测喂食胡萝卜可能会增强小鼠的免疫功能.

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

实验动物是3月龄雄性昆明小鼠(购于济南朋悦动物有限公司)，单笼饲养(30 cm×15 cm×20 cm)，饲养温度为23±1 ℃，光周期为12L∶12D(Light∶Dark)，垫料为锯末，食物为标准大小鼠饲料(北京科奥协力饲料有限公司)，自由取食和饮水，单笼饲养两周后，将28只小鼠随机分为胡萝卜和饲料组(Carrot-Food group,n=8)、第二组是只投喂胡萝卜组(Carrot group,n=10)，第三组是只投喂饲料组(Food group,n=10).饲养15 d后将3组小鼠处死.

1.2 体重秤量

每3天同一时间点对小鼠体重进行称量，称量仪器为电子天平(0.1 g).

1.3 动物处死和解剖及器官重量称量

将每一只昆明小鼠用 CO2轻度麻醉后，用灭菌后的剪刀在其颈部剪开取血，将血液滴在离心管内，每一支离心管上都标好标号，然后将其放在冰盒里静置半小时左右，立即放在离心机中 4 ℃ 5000 r/m 条件下离心 30 min，取血清置于新离心管中，在超低温冰箱(-80 ℃)内保存，备用.取血后迅速分离肩胛骨间的褐色脂肪组织(brown adipose tissue,IBAT)，置于 1.5 mL 的离心管内并称重.用消毒灭菌后的手术剪刀和镊子取出动物的心脏、肺脏、胸腺、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺、睾丸、附睾、储精囊等各个器官，并仔细分离各器官表面的结缔组织和脂肪组织，用滤纸吸干分离出的各器官表面的血液和水分，然后称重(精确到0.001 g)，将其作为器官鲜重并将各数据做好记录，将各器官用锡箔纸包裹置于冰箱中冷藏.依次取出胃、小肠、盲肠、结肠并分离开，同样方法清除表面的脂肪组织和结缔组织，秤量胃及内容物、小肠及内容物、盲肠及内容物、结肠及内容物的重量并做好记录，然后将其纵向剖开，用生理盐水洗去内容物，并用吸水纸吸去表面水分和血液，称重，作为器官鲜重并做好实验记录.称量分离出的性腺周围脂肪、腹膜后脂肪、皮下脂肪、肠系膜脂肪的重量，并计算其总重量，作为动物体总体脂重，各脂肪重与终体重的比值为脂肪含量[17].

1.4 白细胞数目的检测

将小鼠麻醉处死后，在其颈部取血，然后立即用移液枪吸取20 μL血液，防止血液冷凝，将其溶在实验前配置好的0.38 mL的白细胞稀释液(含1.5%的冰醋酸和1%龙胆紫)，吹打混匀.接着，用移液枪吸取以上混合液20 μL滴在白细胞计数板上，用10倍显微镜观察并计数，记录视野下白细胞总数，血液中白细胞数(109cells/L)=视野中白细胞数×(5×107)[18-19].

1.5 细胞免疫(PHA反应)的检测

为检测哺乳动物的免疫功能，我们通常在动物足垫位置注射植物血球凝集素(PHA).具体操作步骤如下：首先用75%的酒精擦拭小鼠的左后足足垫并用数显电子测微尺测定其厚度，每只小鼠测量6次，记录数据取平均值作为初始足垫厚度.然后用微量注射器吸取30 μL的PHA注射液(含0.1 mg的pH值为7.4的无菌PBS缓冲液)，注射于足垫的中心处，为保证注入全部的注射液，在注射的时候要轻推.在注射PHA后的6 h,12 h,24 h,48 h，分别测定每只昆明小鼠的的足垫厚度，每次测量6次，最后取平均值作为实验数据.注意在测量过程中为了减小实验测量误差，要保证所有数据都为同一人测量.PHA反应的计算公式为(注射后足垫厚度-初始足垫厚度)/初始足垫厚度[20-21].

1.6 统计方法

在实验数据统计分析时应用SPSS 18.0软件.统计分析之前检验数据是否呈正态分布，用体重做协方差校正，分析方法为单因素方差分析，实验分析结果用平均值±标准误表示，P<0.05表示有显著性影响，相反，P>0.05说明无显著性影响.

2 结果与分析

2.1 体重

3组小鼠在Day 3 (F2,27=1.269,P=0.299)、Day 6 (F2,27=2.217,P=0.13)和Day 9 (F2,27=2.557,P=0.098)中体重无明显差异，但在Day 12 (F2,27=3.806,P=0.036)和Day 15 (F2,27=4.524,P=0.021)中饲喂胡萝卜组小鼠体重明显低于其他2组.

图1 喂食胡萝卜对小鼠体重的影响

2.2 身体成分

喂食胡萝卜对小鼠胴体鲜重、肠系膜脂肪重、腹膜后脂肪重及含量和脂肪总重有显著性影响，且饲喂胡萝卜组小鼠明显低于其他两组(表1).

表1 喂食胡萝卜对昆明小鼠身体成分的影响

2.3 内脏器官

喂食胡萝卜使昆明小鼠肩胛间褐色脂肪组织(IBAT)、肺、肝脏、肾脏和储精囊的鲜重显著降低， 使胃及内容物、小肠及内容物、盲肠及内容物、小肠长度、结肠及内容物、消化道总重、消化道总长显著增加，但是对昆明小鼠脑、下丘脑、心脏、肾上腺、盲肠长度、结肠长度、睾丸和附睾无显著性影响(表2).

表2 喂食胡萝卜对昆明小鼠内脏器官的影响

续表

2.4 免疫器官

喂食胡萝卜对小鼠的胸腺鲜重(F2,27=9.925,P<0.001)和脾脏鲜重(F2,27=6.775,P=0.005)有显著性影响，且喂食胡萝卜组免疫器官鲜重低于其2两组.

图2 喂食胡萝卜对昆明小鼠胸腺(A)和脾脏(B)的影响

2.5 白细胞总数

喂食胡萝卜对昆明小鼠的白细胞总数无显著性影响(F2,27=0.580,P=0.567).

图3 喂食胡萝卜对昆明小鼠白细胞数目的影响

2.6 PHA反应

喂食胡萝卜显著提高了昆明小鼠注射PHA 6h (F2,27=5.419,P=0.011)后的PHA反应，但对注射PHA 12 h (F2,27=1.448,P=0.254)、24 h (F2,27=3.054,P=0.065)和48h (F2,27=0.003,P=0.997)后的PHA反应无显著性影响，PHA反应随时间的增加而降低.

图4 喂食胡萝卜对昆明小鼠PHA反应的影响

3 讨 论

喂食胡萝卜增强昆明小鼠细胞免疫水平，但降低胸腺和脾脏鲜重，对白细胞数目没有影响.

3.1 身体成分

喂食胡萝卜不影响昆明小鼠脑、下丘脑、心脏、肾上腺、盲肠长度、结肠长度、睾丸、附睾以及性周脂肪、皮下脂肪等身体成分的重量.与喂食饲料组和胡萝卜-饲料组相比，喂食胡萝卜组的小鼠体重显著降低，是由于只喂食胡萝卜，提供的营养物质单一，不能满足小鼠生长的全部所需.食物对不同的动物的影响程度不一样，但普遍，当食物种类单一，且数量不足时，动物的免疫能力将会受到抑制，造成抵抗能力下降[22].且同时投喂组和只喂食饲料组小鼠体重之间也没有显著性差异，与Amar等研究的喂食含类胡萝卜素的饲料不会提高虹鳟的生长率和增重率相一致[9].

3.2 免 疫

对于动物体来说，胸腺和脾脏是非常重要的免疫器官，常用来衡量免疫功能.在本实验中，喂食胡萝卜对小鼠脾脏和胸腺鲜重有显著性影响，但与我们预期不同的是，喂食胡萝卜组脾脏和胸腺鲜重显著低于其他两组，我们推测可能是由于只食用胡萝卜营养物质缺乏体重下降所致.

白细胞可用来抵御病原体，但此次实验中，3组昆明小鼠之间白细胞数目没有显著性差异，说明喂食胡萝卜对昆明小鼠白细胞数目无显著性影响.虽然与我们预期不同，但有研究发现，在肉牛的饲粮中添加不同水平的β-胡萝卜素，对其体重和白细胞数目没有显著性影响，与我们研究结果相一致[11].

PHA刺激淋巴细胞的增殖和局部炎症，当被注射到皮肤中或皮肤下时PHA会诱导白细胞浸润从而引起肿胀，其厚度被解释为免疫应答强度的度量[26].PHA可作为反映由细胞介导的免疫力的重要指标[27].一般而言，PHA反应会在6 h达到最大值，在48 h的时候恢复到原始状态.本实验中，喂食胡萝卜组昆明小鼠注射PHA 6 h后，PHA反应显著高于其他两组，但在注射PHA 12 h、24 h和48 h后，3组小鼠PHA反应无显著性差异，说明喂食胡萝卜可提高小鼠的由细胞介导的免疫功能.相关研究表明，饲喂加入β-胡萝卜素的饲料可以显著提高母猪初乳IgM、IgA和IgG的浓度，提高了其免疫功能[23].Von Euler等研究表明β-胡萝卜素具有维生素A的活性，确定了β-胡萝卜素与维生素A之间的关系[24].维生素A是一种重要的免疫增强剂和营养物质，那么本实验中喂食胡萝卜使昆明小鼠细胞免疫的增强是不是与β-胡萝卜素中的维生素A活性有关呢？Bendich发现，免疫功能的增强是β-胡萝卜素的作用而不是因为维生素A的活性[25].同时也有研究发现，对辐射小鼠分别补充β-胡萝卜素、虾青素、斑蝥黄素和番茄红素后，均可使辐射小鼠淋巴细胞数目、NK细胞杀伤活性以及IL-2活性得到显著的提高，除β-胡萝卜素外均不含维生素A活性，因此细胞免疫的提高与是否转化为维生素A无关[14].

总之，喂食胡萝卜可增强昆明小鼠细胞免疫，且只喂食胡萝卜显著降低了昆明小鼠体重和免疫器官鲜重，对白细胞数目无显著性影响.