外源茉莉酸甲酯和异亮氨酸对灰霉菌侵染后圣女果抗病性酶酶活的影响

罗吉庆,张永杰，吴艾频，夏 敏，张 薇

(四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644000)

脱落酸、水杨酸、菜油素内酯等植物激素可对果蔬进行诱导，进而增强果蔬采后贮藏的品质，目前已应用于李果[1]、香蕉[2]、葡萄[3]和蓝莓[4]等水果的采后贮藏。研究表明：植物细胞内存在茉莉酸信号通路途径[5],α-亚麻酸在脂肪氧化酶作用下生成茉莉酸(JA)，并在茉莉酸氨基酸合成酶(JARs)催化下与异亮氨酸(Ile)生成茉莉酸盐(JA-Ile)，JA-Ile能与茉莉酸信号受体蛋白(COI1)结合并泛肽标记茉莉酸信号通路的阻碍蛋白(JAZ)，进而降解并释放茉莉酸通路的转录因子(MYC2)，响应外界环境变化做出应答，增强植物的抗病性和耐受性。

茉莉酸甲酯(MeJA)是JA的甲酯化衍生物[6]，能通过诱导植物合成抗氧化酶，参与作物的次生代谢过程，对提高植物的抗病性和耐受性起到至关重要的作用。在重金属砷[7]的胁迫下，MeJA能协同茉莉酸信号的响应基因，提高多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性，从而提高植物抗逆性。此外，对于盐胁迫[8]、干旱胁迫[9]、低温胁迫[10]等，外源MeJA能提高植物JA-Ile含量，进而提高植物的抗氧化酶酶活和抗氧化活性物质的积累，这对MeJA应用在果蔬的采后贮藏意义深远。

Ile经植物体内JARs作用与JA耦合成活性的JA-Ile，参与植物的抗病性应答，提高植物的耐受性[11]。利用外源的Ile处理葡萄后发现，葡萄的花青素含量较高[12]，外源的Ile能促进活性成分的积累从而提高抗氧化性。

灰霉菌是果蔬常见的灰霉病的致病菌[13]。有研究发现，MeJA能诱导植物的抗氧化酶酶活提高和其他的抗氧化活性成分的积累，从而提高对灰霉菌腐烂的抗病性，该抗性过程主要受JA-Ile调控[14]。

圣女果含有丰富的营养成分且在贮藏期间易发生灰霉病，造成大量腐烂。本研究以外源的MeJA和Ile处理圣女果，并接种灰霉菌，对实验组和对照组的病斑直径和抗病相关酶进行测定，以探究外源MeJA、Ile的协同处理是否能提高抗病性酶酶活，增强圣女果对灰霉菌的抗病性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MeJA、硝基四氮唑蓝(NBT)、核黄素，合肥巴斯夫生物科技有限公司；愈创木酚、苯丙氨酸、蛋氨酸、Ile、EDTA-Na2，合肥博美生物科技有限责任公司；次氯酸、体积分数30%H2O2，成都金山化学试剂有限公司；硼砂、邻苯二酚、浓盐酸、硼酸、Na2HPO4、NaH2PO4、抗坏血酸，成都市科隆化工试剂厂；β-巯基乙醇，上海泽叶生物科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，无锡市亚泰联合化工有限公司。

1.2 仪器与设备

DNP-9025型恒温培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；L3-C85型打浆机，九阳股份有限公司；501型水浴锅，常州智博瑞仪器制造有限公司；UV-1000型紫外可见分光光度仪，翱艺仪器(上海)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1样品预处理

对采后2 d的圣女果用自来水清洗，去掉表面的杂质和果蒂部分，并除去破损的果实。配制体积分数1%的次氯酸钠溶液浸泡圣女果1 min，再用去离子水浸泡1 min，重复3次后，捞出圣女果自然晾干，并分成空白对照组、Ile组、MeJA组和MeJA+ILe组4组。配制10 mmol/L的Ile溶液浸泡Ile组和MeJA+Ile组的圣女果30 min后捞出自然晾干，对照组和MeJA组用去离子水浸泡30 min后晾干，最后将晾干的MeJA组和MeJA+Ile组用10 μmol/L的MeJA密封在容器中，置于30 ℃恒温培养箱，放置48 h后完成熏蒸处理，对照组和Ile组圣女果用等量的体积分数95%乙醇代替MeJA，同等熏蒸条件处理。熏蒸前的圣女果酶活测定为第1次测定点，时间记为-24 h，每隔24 h测定酶活。

1.3.2病原菌接种

将熏蒸完成后的圣女果中轴线部位打孔(直径2 mm、深2 mm)，每个圣女果对称打2个孔。接种5 μL配制好的3×108spores/mL的灰霉菌孢子进行实验，接种完成后测量病斑直径，记作24 h，依次在36、48、72、96、120 h测定病斑直径。

随着人口老龄化的日益加剧，其产生的问题也影响着个人、家庭以及整个社会。预防老年疾病、延缓认知老化、提高老年人的生活自理能力，让老年人安享晚年，已经成为国内外专家学者关注的热点。然而，伴随着增龄进程，老龄化问题也表现出特异性，即老化现象仅体现在某些个体上，而在其他人群中则出现了正常或成功老龄化。这种不一致的现象是如何产生的？身体活动的参与是否是一项重要的影响因素，这些问题都有待回答。本文从成功老化的内涵及特征出发，阐释身体活动对成功老化的促进作用，以期在老龄化突出的社会进程中预防老年疾病，促进老年人成功老龄化。

1.3.3酶活测定

每组取样品圣女果6个，重复3次取样，先用游标卡尺测量病斑直径并做记录。将所选圣女果预冷后完整放入打浆机匀浆30 s，各称取5 g样品测定酶活(以圣女果鲜质量计)，酶活单位U/g。

1)苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活测定[11]：取样品5 g加入10 mL pH值8.8的硼砂-硼酸缓冲液和0.3 g PVP，摇匀静置30 min后，单层滤纸过滤得到粗酶提取液。取1 mL的粗酶液和3 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸混合，置于30 ℃水浴锅反应1 h后取出添加1 mL的6 mol/L盐酸终止反应，调零组以1 mL去离子水代替酶液。290 nm测定吸光度A290并计算酶活，见式(1)。

(1)

式(1)中，V1，粗酶提取液总体积，mL;t,反应时间，min；V2，参与反应的酶液体积，mL;m,圣女果鲜质量，g。

2)多酚氧化酶(PPO)、过氧化物氧化酶(POD)酶活测定：取样品5 g加入10 mL pH值6.4的磷酸缓冲液和0.25 g PVP ，摇匀静置30 min后，单层滤纸过滤得粗酶提取液。取20 μL的粗酶提取液加入3 mL 0.2 mol/L邻苯二酚摇匀后，观察tmin内410 nm波长下吸光度变化值ΔA410，并以20 μL去离子水取代酶液设置调零组，计算PPO酶活,见式(2),结果以1 min吸光度变化0.01为1 U[15]。

(2)

取30 μL的粗酶提取液加入3 mL体积分数1.19%愈创木酚，随后添加100 μL体积分数 0.2%的H2O2摇匀后，于470 nm波长下观察tmin内吸光度变化值ΔA470，其中以30 μL去离子水取代酶液设置调零组，计算POD酶活，见式(3)，结果以1 min吸光度变化0.01为1 U[10]。

(3)

3)超氧化物歧化酶(SOD)酶活测定[9-10]：取样品5 g加入10 mL pH值7.8的磷酸缓冲液和0.3 g PVP，摇匀静置30 min后，单层滤纸过滤得粗酶提取液；随后取50 μL粗酶液依次添加300 μL 130 mmol/L Met、750 μmol/L NBT、100 μmol/L EDTA-Na2、20 μmol/L 核黄素、1.5 mL pH值7.8磷酸缓冲液和250 μL去离子水，构成3 mL的反应体系，并分别设置曝光的对照组L和避光的对照组D，以50 μL去离子水取代酶液添加。添加酶液反应组和曝光对照组L在4 000 lx光强下反应30 min；避光对照组D避光30 min后，在560 nm波长下，用避光对照D组调零，测定曝光对照组吸光度AL和反应组吸光度A560，酶活结果以1 g组织在反应液中SOD抑制率达50%时，所对应的量为一个SOD酶活力单位(U)，计算见式(4)。

(4)

不同小写字母表示相同时间不同处理组的数据差异显著(P<0.05)，不同大写字母则表示差异极显著(P<0.01)。图1 MeJA和Ile处理对灰霉菌侵染圣女果后病斑直径的影响Fig.1 Effects of MeJA and Ile treatment on lesion diameter after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

4)过氧化氢氧化酶(CAT)酶活测定[10]：取样品5 g加入10 mL pH 值7.0的磷酸缓冲液和0.5 g的PVP，摇匀静置30 min后，单层滤纸过滤得粗酶提取液。取200 μL粗酶提取液依次添加1 mL pH值7.0的磷酸缓冲液、1.7 mL去离子水、200 μL体积分数0.2%过氧化氢，构成3 mL反应体系，于240 nm波长测定tmin吸光度变化值ΔA240，以200 μL去离子水取代酶液设置调零组，CAT酶活计算见式(5)。

(5)

5)抗坏血酸过氧化物酶(APX)酶活测定[8,10]：取样品5 g加入10 mL pH值7.0的磷酸缓冲液,摇匀静置30 min后单层滤纸过滤得粗酶提取液。取400 μL粗酶提取液依次添加3 mL pH值7.0的0.1 mmol/L EDTA-Na2、200 μL 0.3 mmol/L抗坏血酸、200 μL 体积分数0.2%过氧化氢，构成3.5 mL反应体系，于290 nm波长下测定tmin吸光度变化值ΔA290，以400 μL去离子水取代酶液设置调零组，APX酶活计算见式(6)。

(6)

1.4 数据处理

实验均取3组平行，重复测定3次。应用Microsoft Excel 2010和SPSS Statistics 24软件进行数据处理，结果以平均值±标准差表示，应用邓肯氏多重比较方法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同处理对圣女果病斑直径的影响

图1为MeJA和Ile处理对灰霉菌侵染圣女果后病斑直径的影响。接种灰霉菌后的圣女果病斑直径随着时间延长而增大，且对照组与实验组均有显著差异(P<0.05)；对照组与MeJA+Ile组病斑直径差异极显著(P<0.01)。120 h时，对照组的病斑直径达到最大值。通过病斑直径的对比，发现经过MeJA、Ile处理后的圣女果接种灰霉菌后的病斑直径较小，圣女果对灰霉菌的敏感性降低。其中，MeJA+Ile组对该过程病斑直径的影响最大，能有效地降低灰霉菌侵染后圣女果的腐烂程度。

2.2 不同处理对抗病性酶酶活的影响

2.2.1对PAL酶活的影响

图2为MeJA和Ile处理对灰霉菌侵染圣女果后PAL酶活的影响。PAL催化苯丙氨酸转化成反式肉桂酸等中间代谢产物，作为木质素、花色苷等抗病性成分合成的前体而增强果蔬在贮藏过程的抗病性和耐受性[16]。本研究对圣女果接种灰霉菌后，PAL酶活呈现上升趋势，72 h时，酶活实现跃变，稍后增长较为平缓，其中MeJA+Ile组与对照组差异显著(P<0.05)。圣女果在接种灰霉菌后PAL酶活保持在较高的水平，灰霉菌引起的腐烂能增强PAL酶活。

不同小写字母表示相同时间不同处理组的数据差异显著(P<0.05)，不同大写字母则表示差异极显著(P<0.01)。图2 MeJA和Ile处理对灰霉菌侵染圣女果后PAL酶活的影响Fig.2 Effects of MeJA and Ile treatment on PAL activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

2.2.2对CAT酶活的影响

图3为MeJA和Ile处理对灰霉菌侵染圣女果后CAT酶活的影响。CAT作为植物细胞的抗氧化酶簇之一，降低了细胞在生理代谢过程中产生的超氧阴离子和H2O2水平，维持了机体细胞正常的机能[11]。圣女果接种灰霉菌后，实验组酶活均高于对照组，MeJA、Ile对CAT酶活提高有诱导效应。经过诱导后的圣女果，在接种病菌侵染后，实验组与对照组酶活差异显著(P<0.05),MeJA+Ile组酶活与对照组差异极显著(P<0.01)。MeJA、Ile诱导能提高圣女果CAT酶活，清除灰霉菌在侵染过程中产生的过氧化物，降低对植物细胞的影响，提高果实的抗病性和耐贮藏性。

不同小写字母表示相同时间不同处理组的数据差异显著(P<0.05)，不同大写字母则表示差异极显著(P<0.01)。图3 MeJA和Ile处理对灰霉菌侵染圣女果后CAT酶活的影响Fig.3 Effects of MeJA and Ile treatment on CAT activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

2.2.3对SOD酶活的影响

图4为MeJA和Ile处理对灰霉菌侵染圣女果后SOD酶活的影响。SOD作为自由基的清除剂，在对圣女果接种灰霉菌的抗病性实验中发现，对照组SOD酶活较低，与实验组差异显著(P<0.05),与MeJA+Ile组差异极显著(P<0.01)。SOD 酶活的提高能有效地降低圣女果在灰霉菌腐烂过程中产生的过氧化物和超氧阴离子对果实的影响，增强圣女果对灰霉菌的抗病性。

2.2.4对APX酶活的影响

不同小写字母表示相同时间不同处理组的数据差异显著(P<0.05)，不同大写字母则表示差异极显著(P<0.01)。图4 MeJA和Ile处理对灰霉菌侵染圣女果后SOD酶活的影响Fig.4 Effects of MeJA and Ile treatment on SOD activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

图5为MeJA和Ile处理对灰霉菌侵染圣女果后APX酶活的影响。APX以维生素C为电子的供体，催化过氧化物，维护机体细胞正常的代谢机制。在接种灰霉菌后，APX酶活普遍提升，对照组与实验组差异显著(P<0.05)，与MeJA+Ile组差异极显著(P<0.01)。APX对过氧化物的清除，降低了灰霉菌侵染过程产生的和机体自身产生的过氧化物在贮藏过程对圣女果的毒害作用，从而有效地提高圣女果的抗病性和耐贮藏性能。

不同小写字母表示相同时间不同处理组的数据差异显著(P<0.05)，不同大写字母则表示差异极显著(P<0.01)。图5 MeJA和Ile处理对灰霉菌侵染圣女果后APX酶活的影响Fig.5 Effects of MeJA and Ile treatment on APX activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

2.2.5对PPO酶活的影响

图6为MeJA和Ile处理对灰霉菌侵染圣女果后PPO酶活的影响。PPO参与酚类的氧化，同时参与木质素的形成，对增强细胞壁的强韧度，增强抗病性和限制灰霉菌真菌毒素的扩散、病原菌的穿透性等方面有一定的效果[17]。此外，MeJA能激活CsPPO2/4的转录而增强PPO活性[18]。本研究发现：接种灰霉菌后，PPO酶活在接种后都会有所提高，这是圣女果对于真菌侵染的基础性的抗病性表现，经MeJA、Ile处理的圣女果，PPO酶活高于对照组，96 h时酶活差异显著(P<0.05);120 h时，MeJA+Ile组酶活与对照组差异极显著(P<0.01)。PPO酶活的提高可能受到MeJA和Ile的影响，经过诱导后，圣女果PPO酶活提高，增强了对灰霉菌引起的腐烂的抗性。

不同小写字母表示相同时间不同处理组的数据差异显著(P<0.05)，不同大写字母则表示差异极显著(P<0.01)。图6 MeJA和Ile处理对灰霉菌侵染圣女果后PPO酶活的影响Fig.6 Effects of MeJA and Ile treatment on PPO activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

2.2.6对POD酶活的影响

图7为MeJA和Ile处理对灰霉菌侵染圣女果后POD酶活的影响。POD催化果蔬贮藏过程产生过氧化氢、氧化酚类、胺类化合物和烃类氧化产物，并作为木质素合成最后一步的关键酶，增强植物细胞壁的强韧性构建，是果蔬抗病性的主要酶活指标。在对圣女果接种灰霉菌的抗病性实验中发现：经过灰霉菌接种后，POD酶活都大幅度地提高，实验组酶活提高迅速，与对照组差异极显著(P<0.01)。POD可能是存在于植物体内的抗病性的基础酶，MeJA、Ile能诱导茉莉酸信号通路而提高POD酶活，增强圣女果对灰霉菌的抗病性，降低贮藏过程中果实腐烂程度。

不同小写字母表示相同时间不同处理组的数据差异显著(P<0.05)，不同大写字母则表示差异极显著(P<0.01)。图7 MeJA和Ile处理对灰霉菌侵染圣女果后POD酶活的影响Fig.7 Effects of MeJA and Ile treatment on POD activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

3 结 论

通过对圣女果接种灰霉菌后酶活的测定和病斑直径观察，本研究发现：PAL、POD和PPO酶活提高，即圣女果自身对灰霉菌的侵染存在一定的抗性。接种灰霉菌的圣女果在病斑直径的差异也从某种程度上说明了MeJA和Ile能有效地提高圣女果的抗病性。外源添加MeJA和Ile处理圣女果，PAL、POD、PPO酶活在实验组中普遍较高，该类酶在合成木质素的功能上发挥较为关键的作用，接种灰霉菌的圣女果经MeJA和Ile处理后，圣女果的内源代谢酶活性得以增强，提高圣女果细胞壁的机械强度，圣女果的抗灰霉菌腐烂的性能得到增强，这种情况与MeJA应用在鲜切菠萝[19]、鲜切苹果[20]、草莓[21]中酶活增强的效果类似。MeJA和Ile处理的圣女果抗氧化酶酶活较高，在侵染致病菌后，实验组的抗氧化酶APX、SOD、CAT酶活整体水平提高，对腐烂过程产生的胁迫因子起到抑制作用，增强了圣女果对腐烂的抗性，这与MeJA应用在番茄[22]中酶活增强的研究相似。

对抗病性的酶活研究，揭示了这6种酶与圣女果对灰霉菌侵染的抗病性存在某种联系，未施加外源MeJA和Ile时，圣女果的茉莉酸信号通路是如何调控这些酶的响应机制仍需进一步探索。但有研究发现，茉莉酸和Ile能在植物细胞内形成JA-Ile偶合物，该有效成分是存在于植物体的可转运化合物[23]，参与植物的生物和非生物胁迫的抗性信号转导，在植物体内的JA-Ile偶联物的形成受宿主的可用Ile的限制，外源施加Ile处理是对该偶联物的补充[24]，这与本研究中观察到实验组病斑直径较小的结果一致。外源MeJA和Ile可能会通过提高圣女果的JA-Ile含量，从而增强圣女果的抗氧化酶酶活，对灰霉菌引起的腐烂产生抵御的作用。本研究以10 mmol/L Ile浸泡处理和10 μmol/L MeJA熏蒸有效地提高了SOD、PAL、APX、CAT、PPO、POD酶活，抑制了接种的灰霉菌的扩张，在贮藏过程中有效控制了圣女果的腐烂，提高了果实的贮藏效果。

茉莉酸能与其他的氨基酸偶联成新的茉莉酸盐，如与苯丙氨酸、缬氨酸等[12]，研究结果对果蔬采后贮藏有重要的指导意义，可利用茉莉酸类化合物联合外源氨基酸增强果蔬贮藏的抗氧化活性，提高果蔬采后的贮藏性，旨在为果蔬的防腐保鲜提供一定的理论依据。