白茶萎凋过程中差异基因的生物信息学分析与表达分析

陈静陈桂信叶乃兴黄先洲潘玉华杨晓滨

(1.宁德职业技术学院生物技术系,福建 福安 355000;2.福建农林大学园艺学院,福建 福州 350002)

白茶萎凋工序是水分逐步散失过程，细胞渗透调节作用下，细胞膜渗透性发生明显改变，引起生化及内质成分的变化，各特征性次生代谢产物酚类物质[1-4]、咖啡碱[5-7]、茶氨酸[8,9]、萜烯类香气物质[10-12]代谢途径中的关键酶及相关基因共同决定白茶品质形成，已陆续在NCBI数据库登录相关基因的序列信息及相关功能注释。本研究从白茶萎凋芽叶-新鲜芽叶正向文库中分离获得了S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶(DAHPS)，并对基因序列进行了生物信息学分析，为以后研究白茶品质形成分子形成机理奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试品种为国家级审定茶树良种“福鼎大白茶”，种植于福建农林大学南区茶学教学基地种质资源圃，按传统白茶加工工艺进行萎凋，室内自然萎凋温度22～25℃，空气相对湿度70%～75%，分别称取0.1000g的鲜叶(萎凋处理0h)和萎凋处理4h、8h、16h、24h、32h、40h、48h、52h的叶片，共9个样品，设3次重复，经液氮速冻后置-80℃冰箱保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 白茶萎凋叶与鲜叶正向抑制差减杂交cDNA文库的构建

各取萎凋芽叶与新鲜芽叶样品总RNA为模板，参考俞滢[13]的方法构建文库。

1.2.2 白茶萎凋叶与鲜叶差异基因阳性克隆的筛选

反向Northern-blotting中探针的制备、点膜、预杂交、杂交、显色等步骤，参照俞滢[13]的方法和Roche公司的DIG High Prime Labeling and Detection Starter Kit I(Version 13)试剂盒的说明书进行，根据反向Northern-blotting的结果，挑取阳性克隆进行培养，用于测序。

经反向Northern Bloting显色验证出的阳性克隆所对应菌液送上海祥音公司测序。利用在线NCBI vecscreen剔除载体序列、删除污染序列和低于并结合300 bp的序列；利用DNAMAN软件对有效序列进行拼接，将测序结果生成fasta文件以供后期生物信息学分析；将测序结果与NCBI核酸数据库和拟南芥蛋白数据库结合进行Blast N比对分析，对基因功能进行注释和归类分析。

1.2.4 白茶品质形成的相关差异基因的生物信息学分析

利用NCBI数据库对阳性克隆的测序结果，见表1，所获得的核苷酸序列和氨基酸序列进行Blast X比对；阳性克隆基因的推测功能使用Protparam在线软件；预测阳性克隆基因所编码的蛋白质二级结构使用SOPMA在线软件，找出与功能密切相关的结构域；系统进化树在MEGA软件中形成以进行聚类分析。

表1 3个白茶品质形成相关基因信息表

1.2.5 白茶品质形成的相关基因在不同萎凋时期的表达量变化

利用Primer Premier 5和Beacon Desiner7软件设计荧光定量PCR引物，见表2。

表2 荧光定量PCR引物序列

2 结果与分析

2.1 白茶Cs SAMDC基因的生物信息学分析与表达

2.1.1 白茶Cs SAMDC基因的生物信息学分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶是合成亚精胺的重要酶类。S-腺苷甲硫氨酸经过S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)催化，生成脱羧SAM，由Put与脱羧的SAM提供的氨丙基合成Spd和Spm，合成亚精胺合成酶和精胺合成酶，目前已在许多植物中克隆到了SAMDC基因，如拟南芥[14]、棉花[15]、番茄[16]、杜梨[17]等。研究表明，SAMDC基因是由一个多基因家族所编码[18]，每一种植物中的SAMDC基因都不止一个，如拟南芥中有4个SAMDC基因[19]、水稻中有4个SAMDC基因[109]、番茄中有3个SAMDC基因[16]。

测序结果，见图3，白茶Cs SAMDC核苷酸序列长度为1355bp,该基因编码的蛋白由334个氨基酸组成，含有SAMDC_redism_C superfamily结构域和活性位点，见图1，相对分子量为38988.23，等电点为5.29，不稳定系数为48.55，属于不稳定脂溶蛋白，在蛋白质二级结构中，28.19%为α螺旋，23.44%为延伸链，7.42%为β转角，40.95%为无规则卷曲。

治愈:治疗三天,患儿没有腹泻症状,精神状态良好;有效:治疗三天,患儿没有呕吐脱水症状,大便次数减少;无效:治疗三天没有任何改善或更加严重。

图1 Cs SAMDC氨基酸结构预测

图2 Cs SAMDC序列的NJ 系统进化树

图3 Cs SAMDC基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列

将Cs SAMDC基因的氨基酸序列，在NCBI数据库中进行BLAST比对，结果表明，该基因与茶树(Camellia sinensis)的同源性为87%、与香附子(Cynodon dactylon)、小麦(Triticum aestivum)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大豆(Glycine max)同源性均为100%。使用MEGA进行NJ系统进化树分析,结果见图2。

2.1.2 白茶Cs SAMDC基因的表达分析

以GAPDH为内参基因，采用荧光定量PCR对白茶萎凋过程中Cs SAMDC基因的相对表达量进行分析，见图4，结果表明，不同萎凋历时下，萎凋前期即萎凋历时0～16h,萎凋后期即萎凋历时24～52h，2个阶段Cs SAMDC呈现先上升后下降的趋势，在萎凋历时4h的相对表达量是最高的，是0 h的4倍。

图4 白茶不同萎凋历时中Cs SAMDC基因的表达分析

2.2 白茶Cs SDH基因的生物信息学分析与表达

2.2.1 白茶Cs SDH基因的生物信息学分析

琥珀酸脱氢酶是参与三羧酸循环-氧化磷酸化的关键酶基因。

测序结果见图7，白茶Cs SDH基因的cDNA核苷酸序列长度为1224bp，包含17 bp的5/-UTR、57 bp的3/-UTR和1150bp的ORF，起始密码子为ATG、终止密码子为TGA；该基因编码的蛋白由388个氨基酸组成，见图5，相对分子量为43239.04，等电点为6.45，不稳定系数为32.15，属于不稳定脂溶蛋白，在蛋白质二级结构中，29.70 %为α螺旋，25.13%为延伸链，13.96%为β转角，31.22 %为无规则卷曲。

图5 Cs SDH氨基酸结构预测

图6 Cs SDH序列的NJ 系统进化树

图7 Cs SDH的核苷酸序列及推导的氨基酸序列

将Cs SDH基因的氨基酸序列，在NCBI数据库中进行BLAST比对，结果表明，该基因与荔枝(Litchi chinensis)、马尾松(Pinus massoniana)、葡萄(Vitis vinifera)、油棕(Elaeis guineensis)的同源性均为100%。使用MEGA进行NJ系统进化树分析结果表明，Cs SDH基因与玉米的SDH基因属于同一分支，见图6。

2.2.2 白茶Cs SDH基因的表达分析

以GAPDH为内参基因，采用荧光定量PCR对白茶萎凋过程中Cs SDH基因的相对表达量进行分析，结果表明，不同萎凋历时下，萎凋历时0～52h,Cs SDH含量呈现缓慢下降的趋势，变化差异不大，在萎凋历时0h的相对表达量是最高的，是52h的6倍。

图8 白茶不同萎凋历时中CsSDH基因的表达分析

2.3 白茶Cs DAHPS基因的生物信息学分析与表达

2.3.1 白茶CsDAHPS基因的生物信息学分析

莽草酸途径是芳香族氨基酸的生物合成途径，同时也控制着芳香族次生代谢产物的产出，连接糖代谢和次生代谢的纽带。磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶是莽草酸途径7个酶促反应中的第1个酶类，是参与次级代谢的主要蛋白。

测序结果见图11，白茶Cs DAHPS基因的cDNA全长为1935 bp，核苷酸序列长度为1682bp,包含65bp的5/-UTR、58bp的3/-UTR和1812bp的ORF，起始密码子为ATG、终止密码子为TGA；该基因编码的蛋白由538个氨基酸组成，含有异戊二烯结构域Isoprenoid_Biosyn_C1 superfamily，见图9，相对分子量为62021.74，等电点为8.82，不稳定系数为42.90，属于不稳定脂溶蛋白，在蛋白质二级结构中，35.36%为α螺旋，16.25%为延伸链，7.32%为β转角，41.07 %为无规则卷曲。

图9 Cs DAHPS氨基酸结构预测

图10 Cs DAHPS序列的NJ 系统进化树

图11 Cs DAHPS的核苷酸序列及推导的氨基酸序列

将Cs DAHPS基因的氨基酸序列，在NCBI数据库中进行BLAST比对，结果表明，该基因与番茄(Solanum lycopersicum)、番薯紫竹(Ipomoea purpurea)、可可(Theobroma cacao)的同源性均为100%，见图10。

2.3.2 白茶Cs DAHPS基因的表达分析

以GAPDH为内参基因，采用荧光定量PCR对白茶萎凋过程中Cs DAHPS基因的相对表达量进行分析，结果表明，萎凋历时0～24h,Cs DAHPS含量呈现缓慢下降的趋势，变化差异不大，在萎凋历时32h的相对表达量是最高的，是52h的5倍。

图12 白茶不同萎凋历时中CsDAHPS基因的表达分析

3 结论与讨论

3.1 白茶萎凋过程品质形成与逆境的关系

白茶萎凋过程中水分及酶活性不断变化，本身就是失水条件下的逆境，因此形成与水分散失条件下相关的基因，本研究分离的白茶Cs SAMDC合成亚精胺的重要酶类家族，BLAST比对结果表明，Cs SAMDC编码的蛋白在氨基酸序列上与茶树、菜豆等植物的SAMDC基因具有较高的同源性，两者均达到85%以上。从图2中Cs SAMDC的系统进化树可知，白茶Cs SAMDC属于SAMDC家族，与山茶属茶树形成一个分类群，可以初步确定Cs SAMDC是编码白茶的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的同源基因。S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶是合成亚精胺主要限速酶基因。白茶在萎凋历时4h,SAMDC酶表达量最高，说明体内可能产生大量的亚精胺等物质，通过渗透调节途径来增强能力，之后趋于平衡，可能是渗透调节达到一个平稳饱和阶段，有待进一步研究。

3.2 白茶萎凋过程品质形成与三羧酸循环的关系

白茶萎凋过程是各类酶系活跃的阶段，其中白茶Cs SDH是三羧酸循环关键限速酶基因，其表达量呈现缓慢下降的趋势，可初步判定萎凋失水的含量变化是由高至低，因此Cs SDH在萎凋过程中呈现表达逐渐下调趋势，这与孙跃进[20]的结果相一致，萎凋后期糖酵解途径加强,三羧酸循环减弱。

3.3 白茶萎凋过程品质形成与莽草酸循环的关系

莽草酸循环是芳香族氨基酸的生物合成途径，这些芳香族氨基酸除了用来合成蛋白质外，还作为前提生成种类繁多的具有芳香环结构的次级代谢产物，如木质素、维生素E、花青素、植物抗毒素、吲哚乙酸酯、紫草素、水杨酸、丹宁酸、肉桂酸、黄酮及黄酮类等[21-25]。王芳等[26]研究表明，室内自然萎凋过程中不同白茶品种的谷氨酸脱羧酶(GAD)性整体变化趋势基本一致，即萎凋前期的茶叶GAD活性随谷氨酸(GLU)含量的增加而增强，催化GLU转化为γ-氨基丁酸(GABA)，但随着萎凋叶失水程度的增加，催化成GABA的能力下降，且GABA的降解速度大于生成速度，故其含量在萎凋中后期呈缓慢下降趋势。作为莽草酸途径的第1个酶，白茶Cs DAHPS 在萎凋历时0～24h呈现下调表达，萎凋历时40～52h呈现下调表达，这与王芳的结果基本一致。但在萎凋历时32h呈现最大值，这一结果可进一步研究。